作者：米粒儿
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miRNA是研究最早的非编码RNA研究，随着lncRNA和circRNA的兴起，miRNA研究已失去前沿热点的地位。另一方面，由于miRNA研究论文众多，简单的miRNA-靶分子-通路套路基本维持在2分左右的水平。例如以下两篇近期发表在《Oncology letter》上的论文。
应该如何提升miRNA研究的水平呢？今天米粒儿跟大家分享一篇近期发表在 《Cancer letter》上的论文（IF=6.375），或许你能得到启示。
题目：EGFR/c-myc axis regulates TGFβ silencing miR-524 in gliomas
从题目上看，本文有着比较复杂的机制研究，涉及EGFR/c-myc信号轴和TGFβ通路。在选择miR-524为主要研究对象后，作者首先找到其上游分子EGFR并且指出EGFR通过组蛋白修饰作用调节miR-524。之后验证了miR-524靶分子Smad2，Tead1和Hes1，顺着靶分子找到了下游明星通路TGFβ，Notch和Hippo。
一般的研究到这里就结束了，但是这篇论文在此基础上又发现明星通路下游转录因子c-myc又可以调节上游EGFR的表达，从而形成了一个闭合回路，使研究档次进一步提升。所以纵观全文，既包含上游分子，靶分子，下游通路，又找到闭合回路，从机制上讲研究极为深入。这是本文第一个亮点。
本文的第二个亮点在于，研究主要对象为两个miRNA，分别为miRNA-524-3p和miRNA-524-5p，并且证实二者具有协同作用，共同调节成胶质细胞瘤的增殖和转移。
我们下边具体批讲一下本文主要内容：
1、在GBM中，MiR-524-3p和miR-524-5p表达与EGFR表达呈现负相关
作者在CGGA数据库中选择130例样品。将GBM分为原神经，神经中枢，经典，间叶细胞亚型分别进行分析。发现在经典的GBM亚型中，EGFR表达量最高，并且EGFR vIII的突变比例也最高。
为了鉴别经典的GBM亚型和其他亚型中miRNA表达区别，作者分析了CGGA中64个GBM样品中miRNA芯片表达谱，在下图B中列出了100个表达量改变最显著的miRNA。
其中miR-524-5p和 miR-524-3p在经典GBM亚型中表达量明显降低。并且EGFR的mRNA表达量和miR-524-5p， miR-524-3p表达量明显负相关（图E和F）。
生存分析结果提示miR-524-5p， miR-524-3p和患者预后相关（图G和H）。同时，它们也和患者的病理分级显著相关（图I和J）。
2、miR-524-5p 和 miR-524-3p以协同效应抑制胶质瘤的细胞侵袭，增殖和细胞周期
在U87和LN229细胞中过表达miR-524-5p和miR-524-3p后，分别检测细胞侵袭和细胞增殖能力的变化。发现miR-524-5p和miR-524-3p可降低胶质瘤的侵袭和转移能力，并抑制细胞增殖。
为了评价2个miRNA共同作用效率，作者分别建立了3个不同的表达体系：
（1）miR-524-5p 0nM + miR-524-3p 30nM，（2）miR-524-5p 30nM + miR-524-3p 0nM，（3）miR-524-5p 15nM + miR-524-3p 15 nM。实验结果表明体系3中细胞侵袭能力和增殖能力都比体系1和2更低，相似的，细胞周期分析结果也显示体系3中阻滞在G0/G1期的细胞数量更多。
3、EGFR放大/ EGFR vIII通过组蛋白修饰抑制Pri-miR-524表达
为了验证EGFR / EGFR vIII是否影响Pri-miR-524表达，分别采用EGF刺激，EGFR vIII病毒，EGFR抑制剂（MK2206）处理U87细胞。并采用RT-PCR和western blot检测Pri-miR-524表达，结果显示EGF和EGFR vIII处理后Pri-miR-524表达升高，而MK2206处理后Pri-miR-524表达降低。并且EGF和EGFR vIII处理后，AKT和STAT3磷酸化水平升高，EZH2表达升高。
接下来，作者探讨EGFR/EGFRvIII 如何降低miR-524表达量呢？众所周知，EZH2可导致H3K27的三甲基化，并且H3K4me3 和 H3K27me3二价区域可平衡发育基因的表达。因此为了检测Pri-miR-524启动子区的二价区主要功能，采用ChIP联合RT-qPCR方法，检测CpG岛的特异性结合。
结果显示H3K4me3和H3K27me3富集在Pri-miR-524启动子区。而过表达EGFR/EGFR vIII 降低Pri-miR-524启动子区H3k4me3的富集量，提高H3K27me3的富集量。而当采用MK2206处理后，趋势相反。这些实验结果表明EGFR/EGFRvIII可通过与二价区域反应沉默Pri-miR-524。
4、MiR-524-3p靶向Smad2，MiR-524-5p靶向Tead1，且它们共同靶向Hes1
在确定了上游调节分子后，作者下一步策略为寻找miR-524的靶分子。作者首先对CGGA数据库中的数据进行聚集分析，接着采用不同miRNA数据库初步确定miR-524可能作用的mRNA为Hes1，Smad2和Tead1。通过相关性分析，发现miR-524-3p表达与Smad2和Hes1 mRNA表达负相关，miR-524-5p与Tead1和Hes1表达负相关。
采用Luciferase reporter实验证实进一步验证数据库结果。并且在miR-524-3p/miR-524-5p转染的细胞中敲除Smad2/Tead1/Hes1后，检测细胞侵袭，转移和增殖能力减弱。
5、MiR-524调节TGFβ，Notch和Hippo通路
已经有了靶基因，那么它的下游通路是什么呢？作者对Smad2，Tead1和Hes1在四类分子亚型中进行聚集分析，发现Smad2，Tead1和Hes1在经典亚型中表达显著升高。采用Western blot分析TGFβ，Notch和Hippo通路相关marker表达。并且发现miR-524表达升高时，这些通路共同沉默C-myc。
6、C-myc 活化EGFR表达和EGFRvIII 突变
在上面的实验中，作者发现miR-524抑制c-myc表达，为了深入研究该作用机制，构建了CRISPR-miR-524-on体系。首先miR-524调节EGFR vIII抑制的c-myc表达。Western blot和q-PCR结果证实EGFR vIII处理后，c-myc表达降低。
而采用CRISPR-on体系过表达miR-524后，c-myc抑制效应被逆转。最后，我们发现不仅c-myc被抑制，EGFR/EGFR vIII 的表达也被降低。
那么miR-524是如何降低EGFR/EGFR vIII 的表达呢？这是因为c-myc可作为EGFR启动子的转录因子。如下图7G所示，作者证实c-myc可结合在EGFR/EGFR vIII 的转录启示位点。并且采用ChIP-PCR实验进一步证实c-myc直接调节EGFR/EGFR vIII 的表达。
7、MiR-524-3p 和 miR-524-5p 共同抑制体内肿瘤形成
最后在体内实验中作者也证实miR-524可抑制肿瘤形成，并影响Smad2，Hes1和Tead1的表达。
参考文献：EGFR/c-myc axis regulates TGFβ silencing miR-524 in gliomas
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