作者：米粒儿
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随着lncRNA，circRNA兴起，miRNA已经渐渐失宠。但是今天米粒儿依然想为大家分享一篇miRNA研究论文，该论文凭借miRNA+靶基因+明星通路的套路化研究，依然能发表在12分的Hepatology上，它有什么秘诀呢？（回复170831可下载，一周有效）
第一：这篇文章选择将miRNA和耐药相结合，选取临床治疗晚期肝癌的唯一获批药物索拉非尼为研究对象，发现miR-7可逆转索拉非尼耐药，证实miR-7可作为难治或者药物抵抗的HCC潜在治疗靶点。
第二：这发现了miR-7的新的靶点TYRO3，它是受体络氨酸酶TAM家族成员之一。在获得性耐药细胞株中高表达，TYRO3可以通过PI3K/AKT通路调节Huh-7细胞的增殖，迁移和转移能力。本文首次报道TYRO3/PI3K/AKT信号通路介导的索拉非尼获得性耐药的机制。
机制图
本文研究思路如下图所示，（1）通过体内/体外表型实验证实主变量miRNA在HCC增殖和转移过程中发挥重要作用；（2）在（1）的基础上，作者主要找寻miRNA的靶分子，采用了RTK抗体芯片和Target Scan数据库方法；（3）验证靶基因表型包括增殖和转移，以及下游明星通路PI3K/AKT，NFκB 和RAF/MEK/ERK。（4）回复实验验证miRNA通过调节靶基因介导下游通路；（5）探讨miRNA/TYRO3/PI3K/AKT 信号轴在索拉非尼耐药中的作用。
下边我们详细批讲本文主要内容
结果1：在体内体外实验中，miR-7是HCC生长的抑制因子
在HCC中，EFGR的持续激活通过调控下游通路PI3K/AKT，PAK和Raf/MEK/ERK，促进肿瘤的发生和发展。由于miR-7在HCC中低表达，所以本文首先探讨miR-7过表达的效应，发现miR-7过表达呈现明显的抗增殖，抗侵袭和转移表型，并且克隆形成能力降低(Fig 1a)。过表达后，细胞毒性明显升高（Fig 1b）。
接下来，作者研究miR-7在原位HCC中的作用。NSG免疫缺陷小鼠中静脉注射miR-7或者对照组（Fig 1c）。在静脉注射14天后分析发现，注射miR-7小鼠肿瘤负荷明显降低，AFP水平也明显降低（Fig 1d）。这主要与肿瘤体积和体重降低有关。
综上所述，这些数据表明miR-7是HCC增殖、侵袭和转移主要的抑制因素。
结果1
结果2：TAM家族成员TYRO3在HCC中表达升高且是miR-7的靶基因
考虑到miR-7在HCC的重要作用，作者下一步主要任务是寻找miR-7的新靶点。在这里作者用到了磷酸化受体酪氨酸激酶（RTK）抗体芯片分析，结果显示miR-7显著性的降低EGFR和IGF1R的磷酸化水平（Fig 2a， #2和#5）。
此外，miR-7还可降低FGFR4和TYRO3的磷酸化水平（Fig 2a，#3和#6）。并且Target Scan分析揭示FGFR4和TYRO3都包含miR-7的种子序列。但是在之前的研究中已经证明FGFR4可作为HCC治疗的潜在靶点，且相应的小分子抑制剂也已被研究开发。所以作者并没有将其选为本文研究靶点。
相反的TYRO3在HCC中研究刚刚兴起且前期研究表明在慢性白血病和卵巢癌中，它的表达与化疗和靶向治疗的耐药性相关。因此在作者推测TYRO3异常表达可能是HCC中SR形成的关键因素。
到目前为止，由于种种限制，TYRO3特异性的分子抑制剂还未研发，但是如果采用miR-7直接靶向TYRO3可能成为抑制TYRO3特异性表达的重要手段。
结果2
当miR-7在Hub-7或者HEP3B细胞中过表达后，发现TYRO3的mRNA 和蛋白表达水平都显著性降低（Fig 2b）。进一步的，作者采用荧光报告基因实验证明TYRO3是miR-7的靶基因。瞬时转染miR-7后可减低TYRO3的荧光活性（Fig 2c）。
临床实验结果也证实TYRO3在癌组织中表达明显高于正常组织（Fig 2d）。并且TYRO3表达较高的HCC患者预后更差（Fig 2e）。
结果3：TYRO3通过PIE3/AKT通路调节HCC细胞的增殖、侵袭和转移能力
为了研究TYRO3在HCC中的作用，作者建立2个siRNA在Huh-7和HEP3B细胞中，敲减TYRO3。结果显示，敲减TYRO3后，细胞增殖和迁移能力下降（Fig 3a，b，c）。
既然TYRO3可调节HCC细胞增殖，侵袭和转移能力，那么它的下游通路是什么呢？作者分析了不同的下游信号分子。
首先是PI3K/AKT通路，在TYRO3缺失的Huh-7细胞中，AKT磷酸化水平明显下降，而PTEN表达水平不变（Fig 3d）。
其次，NFκB 和RAF/MEK/ERK通路，Rel A和ERK1/2磷酸化水平升高（Fig 3d）。以上结果表明经典PI3K/AKT通路转导TYRO3促肿瘤形成信号。
而且，在TYRO3表达减低的细胞中，替代通路RelA/NFκB可以被激活。
结果3
结果4：外源性miR-7调节TYRO3介导的转移表型
为了理解miR-7/TYRO3信号轴在Huh-7细胞中的生物作用，本文采用回复实验。首先采用anti-miR暴露48h敲减miR-7，接着敲除TYRO3。作者假设如果TYRO3是miR-7的直接作用位点，外源性敲减miR-7后TYRO3会出现过表达现象，而接下来siRNAs引入则会拮抗这种作用。
结果显示敲减外源性miR-7后并不影响Huh-7细胞增殖（Fig 4a）但是会显著性促进细胞侵袭和转移（Fig 4c-d）。而TYRO3缺失并不影响Huh-7细胞增殖（Fig B）但是显著性的拮抗了由anti-miR-7引起的细胞侵袭和转移（Fig 4c-d）。
综上所述，这些数据表明在HCC中miR-7和TYRO3呈现负向调节关系。
结果 4
结果5：miR-7 逆转 TYRO3缺失引起的促炎因子的大量表达
TAM受体缺失与许多促炎细胞因子和趋化因子异常表达相关，而促炎因子和趋化因子与细胞增殖相关。因此，接下来作者选择2个HCC相关的细胞因子CXCL10和IL-8/CXCL8，而且这两个细胞因子本身可能与miR-7靶向结合。
实验结果发现，TYRO3缺失显著性提高CXCL10和IL-8/CXCL8的表达（Fig 4e）。而且过表达miR-7降低CXCL10和IL-8/CXCL8的表达。基于以上实验结果可发现miR-7不仅仅调节TYRO3表达同时也改变主要促炎细胞因子的表达。
这一特性说明miR-7在HCC中具有广泛的生物效应且具有作为HCC细胞增殖抑制因子的能力。
结果6：在HCC中通过miR-7通过抑制TYRO3逆转索拉非尼耐药性
为了研究索拉非尼获得性耐药机制，作者首先建立了两个耐药细胞系Huh-7/SR1，Huh-7/SR2（Fig 5a）。MiR-7在耐药细胞株中表达显著降低，而TYRO3的mRNA表达显著性升高（Fig 5b）。
同时作者还发现在获得性耐药细胞株中，EGFR通路蛋白表达下降。TYRO3蛋白水平也升高，且pRelA表达也升高（Fig 5c）。pAKT和 pERK1/2 在两株耐药细胞株中表达刚好相反（Fig 5c）。
进一步的研究发现，这种差异效应可能和前体细胞差异有关。与母细胞相比，Huh7/SR1细胞增殖能力更强，而Huh-7/SR2细胞系增殖能力较弱（Fig 5d）。两株耐药细胞株的迁移和侵袭能力更强（Fig 5d）。
结果 5
此外，前期研究中发现TYRO3异常表达在结直肠癌中调节EMT过程。因此在本文中作者也观察了EMT现象。发现Huh-7/SR2细胞失去了上皮特性，获得了间质细胞特性（Fig 5E）。
进一步的，TYRO3缺失在母细胞和抗性细胞中都会降低细胞增殖能力（Fig 5F）。最后，作者发现siTYRO3和索拉非尼共同处理后，显著性增强索拉非尼对母细胞Huh-7细胞系的细胞毒性（Fig 5F）。
接下来，作者主要探讨miR-7对索拉非尼耐药细胞的影响。发现与siTYRO3相似，miR-7也显著性降低Hub-7/SR1和Hub-7/SR1并且削弱其迁移和侵袭能力（Fig 6a-b）。
miR-7在Huh-7/SR2细胞系中，增强E-cadherin表达，并且引起多个与生存相关分子表达降低（TYRO3, pAKT, panAKT, pERK 和total RelA）（Fig 6C）。而在miR-7表达降低时，TYRO3的配体GAS6能够显著增强Huh-7/SR2细胞系的迁移和侵袭能力，而在miR-7存在时这种效应被逆转（Fig 6D）。
进一步的，在miR-7存在情况下，GAS6导致的侵袭转移能力现象消失。最后，当用固定浓度miR-7处理索拉非尼耐药细胞系Huh-7细胞时，EC50明显下降（Fig 6E-F）。采用加和模型可发现miR-7和索拉非尼存在协同作用。
结果6
参考文献：A miR-7/GAS6/TYRO3 axis regulates the growth and invasiveness of sorafenib-resistant cells in human hepatocellular carcinoma
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