最近几年Science, Nature, Cell等杂志陆续报道了一些lncRNA编码的小肽（长度小于100 aa，如SERCA，Toddler，MLN，SPAR等）与肌肉功能和胚胎发育相关。但是，还没有功能性小肽在癌症中被发现和证实。Molecular Cell最近的文章报道了lncRNA HOXB-AS3编码的一个53 aa的小肽参与抑制结肠癌（CRC）的增殖，填补了这个空白，暗示lncRNA编码小肽可能是非常有潜力的研究方向。
本文作者在转录组和翻译组等前期工作的基础上，选择了候选lncRNA HOXB-AS3进行编码能力的研究，进而用一系列功能实验证实lncRNA编码的小肽而不是lncRNA在癌症中发挥了作用。通过这篇文章，我们能够学习在筛选具有编码潜力的候选lncRNA之后，如何开展下游功能学实验。
发表期刊：Molecular Cell
影响因子：12.18
发表时间：2017.10
作者首先筛选癌症相关的候选lncRNA HOXB-AS3，并且发现其具有编码潜力，进而将重点放到了lncRNA还是其编码的蛋白发挥着功能。通过一系列的功能实验证明了lncRNA能够编码小肽，并且能够抑制癌症细胞增殖，主要从以下几个方面进行研究。
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首先，构建体外融合蛋白表达载体，GFPwt起始密码子为ATGGTG，而GFPmut则突变为ATTGTT；HOXB-AS3 ORF的起始密码子从ATG突变为ATT。另外，GFP较长，作者同时构建了融合片断的FLAG蛋白表达载体（图1）。此外，已报道有些小肽ORF需要5’ UTR引导翻译，作者同时设计了ORF和5’ UTR ORF做为对照。
图1. HOXB-AS3-GFP/FLAG融合蛋白wt和mut载体构建
其次，利用GFP fluorescence，Western blot和HOXB-AS3 peptide immuno-staining（anti-HOXB-AS3/GFP antibody）检测融合蛋白表达情况，结果显示ORF和5’ UTR ORF都能够起始翻译并与GFP融合，从而能够被检测到;而5’ UTR ORFmut-GFPmut不能形成HOXBAS3-GFP融合蛋白(图 2).HOXBAS3-FLAG融合蛋白也有类似的结果。
图2. GFP fluorescence，Western blot和HOXB-AS3 peptideimmuno-staining（anti-HOXB-AS3 antibody）检测融合蛋白表达
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利用anti-HOXB-AS3 antibody，在CRC SW620和SW480细胞系中检测到HOXB-AS3小肽（图 3A），并且在colon, breast, ovarian和nasopharyngeal癌症细胞系中得到证实（图 3B）。为了排除HOXB-AS3小肽是由其它长的蛋白加工的副产物，作者设计anti-HOXB-AS3 translation-blocking antisenseoligo，结果显示阻止了HOXB-AS3小肽的表达（图3C）。
图3. 利用抗体和antisense oligo检测HOXB-AS3小肽的内源性和特异性
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作者检测到小肽在癌组织中的表达量比癌旁组织要低，Kaplan-Meier生存分析显示低水平HOXB-AS3小肽的患者CRC预后死亡率要更高（图 4G和4H）。
图4 小肽的表达水平与CRC预后死亡率相关
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作者首先干扰抑制了lncRNA HOXB-AS3的表达，促进了癌症细胞的生长。为了弄清lncRNA还是其编码的小肽发挥着作用，作者接着利用HOXB-AS3 ORF和5’ UTR-ORF载体都表达出HOXB-AS3小肽；通过迁移和侵袭，细胞增殖等一系列细胞学实验显示HOXB-AS3小肽能够抑制癌症的发展(图 5A-5C)。动物体内成瘤实验也能明显地反映癌症发展情况（图 5D-5E）。相反，5’ UTR-ORFmut载体不能编码HOXB-AS3小肽，不能影响CRC癌症细胞的活性。这些实验表明HOXB-AS3小肽而不是lncRNA发挥着功能。
图5. 细胞学实验检测HOXB-AS3小肽抑制癌症细胞活性
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作者利用Co-IP实验鉴定有485种蛋白可以与HOXB-AS3小肽结合。为了研究这些结合蛋白的生物学功能，通过STRINGv10构建蛋白质互作网络，发现大多数结合蛋白与RNA剪切相关。根据已报道hnRNPA1能够参与PKM的剪切和PKM2生成，从而与癌症细胞代谢密切相关，最后作者挑选了剪切抑制因子hnRNPA1作为进一步研究对象。
图6.HOXB-AS3小肽结合蛋白间互作网络研究和GO注释（红框内是作者挑选的剪切因子）
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最后作者在前人的报道的基础上，阐明了HOXB-AS3小肽抑制癌症的功能机制。在正常细胞中HOXB-AS3小肽与hnRNP A1 RNA-binding RGG box结合，抑制了PKM2 isoform的形成，使PKM1占主导作用，细胞进入正常代谢过程。相反，在癌症细胞中，HOXB-AS3小肽的缺失导致PKM2 isoform的形成，细胞进入异常代谢过程。
作为一篇权威杂志有关非编码的翻译文章，有较多思路值得关注：
1. 利用RNA-Seq数据挖掘癌症相关的lncRNA，通过Ribosome profiling筛选能够与核糖体结合的lncRNA，进而找到具有翻译潜力的lncRNAHOXB-AS3作为研究对象；
2. 实验设计的多样性：如果lncRNA不能翻译，那么可以从RNA层面研究lncRNA参与癌症的功能机制；如果lncRNA能够翻译，则增加了研究的分量，可以同时研究lncRNA和蛋白；
3. 本文的亮点是幸运的筛选到lncRNAHOXB-AS3不直接发挥作用，而是以编码的小肽行使功能。由于该类文章还较少，这种机制还有待进一步研究来确定是否具有普遍性；
4. 作者找出所有小肽结合蛋白，通过分析发现与RNA剪切相关。再根据已有的报道hnRNPA1剪切抑制因子参与了癌症细胞代谢，锁定了小肽结合蛋白hnRNPA1进行机制研究，提高了实验成功机率。
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