基迪奥客户文章-多组学分析香蕉成熟的调控机制

果实成熟是一个很复杂的、受到多种转录因子调控的生物学过程。目前关于果实成熟的研究成果和文章非常多，仍然还没完全阐明这个生物学过程。脱水反应元件结合蛋白（DREB）属于AP2/ERF转录因子家族成员，在过往的研究中已被报道在植物抗非生物胁迫过程中发挥着重要作用，但其在果实发育过程中的作用还没被阐明。

针对这一科研问题，华南农业大学在2017年4月的《New Phytologist》上发表题为“The transcriptional regulatory network mediated by banana (Musa acuminata) dehydration-responsive element binding (MaDREB) transcription factors in fruit ripening”的文章，利用ChIP-Seq、RNA-seq、以及报告基因实验、凝胶迁移实验等分子实验揭示了香蕉果肉成熟过程中DREB的调控机制。在这个项目中，基迪奥帮助客户完成了RNA-seq测序、ChIP-Seq与RNA-seq数据关联分析，为阐明DREB的调控机制奠定了基础。

合作单位：华南农业大学园艺学院陆旺金课题组

发表杂志：《New Phytologist》

影响因子：7.33

文章整体研究思路

实验设计

1. 研究MaDREB受乙烯诱导表达的实验设计：

   三种处理：乙烯处理、乙烯抑制剂1-甲基环丙烯（1-MCP）处理、乙烯和1-MCP同时处理，以及未处理正常成熟对照组的不同成熟时期香蕉样本。

   

   
   

2.  RNA-seq和ChIP-Seq的实验设计：

   未成熟（乙烯处理前）和成熟（乙烯处理5d）的香蕉样本，三个重复。

研究结果

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MaDREB基因的表达受乙烯诱导

RNA-seq结果鉴定出9个DREB基因，通过与其他近缘物种的DREB基因进行序列比对和进化树分析，证明这9个DREB基因是属于转录因子DREB家族成员的。

为了揭示这9个DREB基因在香蕉成熟过程中的作用，利用qRT-PCR检测这9个DREB基因在四种不同处理的香蕉成熟过程中的表达量。结果与RNA-seq结果一致，9个DREB基因的表达量在乙烯处理组显著上调，并且MaDREB1到MaDREB4的表达趋势与乙烯含量变化一致，即在成熟阶段大量表达（图1）。而MaDREB5到MaDREB9的表达量在乙烯表达量达到高峰前就很高了，说明在香蕉成熟的过程中，MaDREB5到MaDREB9发挥的作用可能没有MaDREB1到MaDREB4重要。

为了证明MaDREB基因的表达是受乙烯诱导的，分别采用GUS报告基因和GFP绿色荧光蛋白融合MaDREB1和MaDREB2启动子载体转化番茄果实和烟草原生质体，结果发现GUS和GFP只在乙烯处理组表达（图2），说明MaDREB1到MaDREB4比其他的MaDREB基因家族成员在香蕉成熟过程中发挥着更加重要的作用。

图1. qRT-PCR检测MaDREB1到MaDREB4在四种不同处理的香蕉成熟过程中的表达量变化

图2. GUS和GFP报告实验检测MaDREB1和MaDREB2启动子活性

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MaDREB的亚细胞定位与转录活性研究

对MaDREB1到MaDREB4进行亚细胞定位研究，发现这四个MaDREB基因都定位于细胞核中（图3 a）。对MaDREB的转录活性分别进行GAL4和LUC报告基因实验，结果都显示MaDREB1到MaDREB4具有转录活性，能够激活半乳糖苷酶与LUC基因的表达（图3 c,e），并且是MaDREB蛋白的C端发挥了这种转录活性（图3 d）。

图3. MaDREB1到MaDREB4的亚细胞定位与转录活性

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ChIP-Seq研究MaDREB2在全基因组范围内的结合区域

首先制备MaDREB2的多克隆抗体，然后在未成熟和成熟的香蕉果肉中进行染色质免疫沉淀实验，对沉淀下来的DNA进行测序，每组三个生物学重复。三个生物学重复样本的ChIP-Seq结果分别鉴定出1961,1347和1175个peak，其中697个peak是共有的，这697个高度可信的peak用于后续的分析研究（图4 a）。

MaDREB2的DNA结合位点在全基因组范围内的多个不同区域都有分布，但最主要是在转录起始位点上游2kb内，并且主要富集于TSS附近（图4 b,c）。另外，对MaDREB2结合位点的染色体分布进行研究，发现MaDREB2并不特异结合与某一染色体上（图4 d）。对MaDREB2结合基因进行GO注释，发现参与了多种生物学过程，包括信号转导、植物激素信号通路、细胞间和细胞内信号转导等（图4 e）。

利用MEME分析MaDREB2的结合motif，共鉴定出三种丰度最高的motif，其中，(A/G)CC(G/C)AC在72.3%的结合位点中都出现（图5），并且与DREB转录因子的经典结合位点DRE/CRT-binding motif ((A/G)CCGAC)高度相似。

图4. MaDREB2的ChIP-Seq结果

图5. MaDREB2结合motif分析

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MaDREB2靶基因表达模式分析

对未成熟和成熟的香蕉果肉进行RNA-seq分析，并联合分析ChIP-Seq和RNA-seq的结果，发现81个（11.6%）MaDREB2靶基因表达量上调，115个（16.5%）MaDREB2靶基因表达量下调，说明这些基因在香蕉成熟过程中受到MaDREB2的直接调控（图6）。

但是上述的报告基因实验证明了MaDREB2的转录激活活性，这说明MaDREB2也可能具有转录抑制的作用。这些差异表达的基因参与了果实成熟、胁迫应答、转录调控和翻译后修饰等等的生物学过程。

图6. MaDREB2靶基因与RNA-seq差异表达基因的维恩图

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MaDREB2在香蕉成熟过程中的调控作用

为了找出香蕉成熟过程中受MaDREB2调控的靶基因，在全基因组范围内搜索包含MaDREB2 结合motif (A/G)CC(G/C)AC的基因。共找到23504个基因的启动子区包含至少一个motif，这些基因包括了数个与香蕉成熟两个最显著特性——变软和散发香味相关的基因，如Expansin 1、xyloglucan endotransglycosylase3、alcohol dehydrogenase1等（图7 a）。

通过ChIP-qPCR来验证MaDREB2与这些基因的结合，结果也显示MaDREB2能够紧密结合在这些基因的启动子区（图7 b）。另外，凝胶迁移实验（EMSA）结果也表明MaDREB2能够结合这些靶基因；所有的这些靶基因的表达量都在香蕉成熟过程中上调（图7 c）。

图7. MaDREB2在香蕉成熟过程中的调控作用

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MaDREB2能够结合到自身基因的启动子上

由于从ChIP-Seq结果中我们发现MaDREB2基因也是MaDREB2转录因子的靶基因，因此利用ChIP-qPCR、EMSA实验来进行验证。结果都证明了MaDREB2能够结合到自身基因的启动子上，表明MaDREB2在调控果实成熟的过程中存在着正向反馈（positive feedback loop）。

图8. MaDREB2能够结合到自身基因的启动子上

总结

综合上述结果，我们可以总结出MaDREB2转录因子在调控香蕉成熟过程中的分子机制：MaDREB2能够被内源或外源的乙烯诱导表达，从而激活了下游一系列的转录调控反应，正向或负向调控了与果实成熟、胁迫应答、转录调控、翻译后修饰相关的基因的表达；同时，MaDREB2能够结合到自身基因的启动子上，扩大自身的转录水平（图9）。

图9. MaDREB2在调控香蕉成熟过程中的分子机制

本文研究思路清晰，先通过序列分析、表达模式分析等方法缩小研究范围、从9个MaDREB家族成员中锁定研究目标MaDREB2；然后进行MaDREB2的ChIP-Seq和RNA-seq，联合两个组学的数据快速找出受MaDREB2调控的靶基因；最后是对这种转录因子结合调控作用进行ChIP-qPCR、EMSA实验验证。整个研究逻辑完整，论据充分，因此才可以实至名归地发表了《New Phytologist》这样的高分杂志。

参考文献：

【1】Kuang, J.-F., Chen, J.-Y., Liu, X.-C., et al. (2017), The transcriptional regulatory network mediated by banana (Musa acuminata) dehydration-responsive element binding (MaDREB) transcription factors in fruit ripening. New Phytol, 214: 762–781. doi:10.1111/nph.14389.