RNA结合蛋白（RBPs）在基因调控过程中扮演着关键作用，目前除了少数的RNA能以核酶的形式单独发挥功能，大部分的RNA是与蛋白结合形成RNA-蛋白复合物，RBPs对于RNA的合成、选择性剪接、修饰、转运和翻译等生命活动的调控都具有关键作用，所以研究RNA和蛋白的相互作用是探索RNA功能的关键。
以蛋白为核心研究相互作用的RNA分子是常见的研究RNA和蛋白相互作用的思路，并且已有很多技术应用在这一研究领域，例如RIP（RNA immunoprecipitation）技术、CLIP（cross-linking and immunoprecipitation）及其各种衍生技术（HiTS-CLIP，PAR-CLIP，iCLIP，eCLIP等）。
目前，RIP是最常见的基于蛋白研究RNA-蛋白相互作用的技术，RNA免疫共沉淀测序技术（RIP-seq）是将RIP与新一代测序技术（NGS）相结合，能够高效地在全转录组范围内检测与特定RBP相互作用的RNAs，得到全转录组范围内与特异蛋白互作的RNAs信息。
已有很多研究利用RIP-seq，揭示了与蛋白互作的RNAs，不仅包括mRNA，还有lncRNA、circRNA和miRNA等。下面列举了四篇比较经典的、研究不同类型蛋白互作RNAs的文章，其中的研究思路可供参考。
Sm蛋白是一个高度保守的RBPs家族，在真核生物中，Sm蛋白结合RNAs形成小核糖核蛋白（RNP）复合物，在基因调控过程中发挥关键作用，所以全面了解Sm RNPs的RNA组分对理解其功能至关重要。
针对Sm蛋白多聚体不同组分设计抗体，利用RIP-seq，鉴定果蝇卵巢和人HeLa细胞中与Sm结合的RNAs。
果蝇卵巢和人HeLa细胞RIP-seq结果均显示，Sm蛋白结合最多的是已经被熟知的小核（snRNAs），在果蝇中确定了11 个不同的 Sm-class snRNAs:U1, U2, U4, U5, U6, U7, U4atac, U6atac, U11, U12 和 LU。
Sm蛋白还和一些核仁RNAs（snoRNA）、小卡哈尔体RNAs（scaRNAs）显著相关，有已经报道过的U85、U87和U89，还有一些新发现的，如snoRNA:Prp8，未注释的ncRNA SHAN。 scaRNAs是一类ncRNA，可以引导snRNAs的甲基化和假尿苷化。
RIP-seq结果还显示Sm蛋白与编码线粒体蛋白和翻译相关蛋白的mRNAs相结合，并且Sm蛋白、snRNAs和mRNAs的结合模式在脊椎动物和无脊椎动物中是保守的。
图1 Sm相关的RNAs
RNA选择性剪接在癌症中扮演着重要角色，异质核糖核蛋白L（HNRNPL）是一种RNA结合蛋白，可以直接调控很多RNAs的选择性剪接，还能通过反向剪接调控环状RNAs（circRNA）的形成。
利用全基因组范围内CRISPR/Cas9敲除，确定对于前列腺癌细胞系LNCaP的生长具有调控作用的RBPs或RNA加工因子，最终挑选HNRNP家族成员中表现最为显著的HNRNPL进行RIP-seq，确定LNCaP细胞系基因组范围内HNRNPL相关的RNAs。最后对HNRNPL干扰LNCaP细胞系和正常LNCaP细胞系进行RNA-seq，确定HNRNPL相关的选择性剪接。
对全基因组CRISPR/Cas9敲除结果进行分析，最终挑选前1000个具有重要生长调控功能的基因进行后续验证，功能富集分析结果显示，LNCaP功能必需基因主要富集在AR和PI3K信号通路上。针对之前研究较少的RBPs进行分析发现，多个HNRNP家族的基因在其中较为显著，随后检测HNRNP家族成员对LNCaP细胞生长的影响，其中HNRNPL表现最为显著。
LNCaP细胞系RIP-seq结果显示，HNRNPL主要结合RNA分子中的CA重复序列或者富含CA的序列， RNAs的峰主要富集在3’UTR和内含子区，暗示HNRNPL参与pre-mRNA的选择性剪接。RNA-seq结果确定了206个选择性剪事件，大部分是外显子跳跃型。circRNA通过pre-mRNA反向剪接产生，RNA-seq结果确定了232个敲低HNRNPL后显著变化的circRNA。HNRNPL结合在内含子侧翼序列会显著增强circRNA的形成，并且敲低HNRNPL显著减少了circRNA的表达。
图2 前列腺癌细胞系中HNRNPL相关的RNAs
EZH2是多梳抑制复合物2（PCR2）的组分，通常在癌症中过表达，影响肿瘤发生和发展，许多ncRNAs可以招募EZH2到特定染色质基因座，调节基因表达。
对人胃癌细胞系，MKN45和AGS，以及一个对照细胞系GES-1进行RIP-seq，分析EZH2相关转录本，包括编码和非编码转录本。
RIP-seq确定了8256个与EZH2相关的RNAs，大多数来自于MKN45，可能因为EZH2在MKN45中高表达。EZH2相关转录本在编码区和非编码区、正负链均有分布，已知的和PCR2相结合的RNAs均被检测到，如HOTAIR、TUG1、ARID4A和AMYD3。EZH2相关的RNAs中，77.5%是编码蛋白的转录本，但一些lncRNA和EZH2显示出很强的亲和性，如HOTAIR和HOTAIRM1。（图3）
图3 EZH2相关的RNAs
LncRNAs在恶性肿瘤扮演很重要的作用，研究结果检测到了848个EZH2相关的lncRNAs，其中MALAT1在MKN45细胞系中高表达。MALAT1通过和EZH2相互作用，抑制原钙黏蛋白因子10（PCDH10）的表达，从而促进胃癌细胞的侵袭和转移。
miRNAs在细胞分化、神经突起和神经元功能等方面发挥着重要作用，Ago2是引导miRNA对mRNA进行剪切或抑制其翻译活性的关键调控因子，是RISC的核心效应物。中风后神经发生和功能恢复相关，在全转录组范围确定Ago2-RISCs相关的miRNAs，可以加深对参与中风后神经发生的miRNAs的理解。
利用Ago2 RIP-seq，分析非缺血性和缺血性成年大鼠侧脑室下区（SVZ）的神经祖细胞（NPCs）miRNAs的表达情况。
结果显示，相较于非缺血性NPCs，中风改变了NPCs中Ago2相关的miRNAs表达，并且发现了新的miRNAs和miRNAs异构体（isomiRs），以及多种miRNA-miRNA*配对，其中新的miRNA pc-3p-17172显著调控NPC增殖和神经分化。
IsomiRs在深度测序中可以被检测到，可以在胚胎干细胞中发挥作用。相较于非缺血性NPCs，缺血性NPCs中的isomiRsreads数增加，其中5’末端添加核苷酸的isomiR-142-5p_L+2R-1显著上调，5’末端缺失核苷酸的isomiR-187-5p_L-2R+3显著下调。（图4）
图4 缺血性NPCs和非缺血性NPCs中Ago2相关的isomiRs
小结：
1. RIP-seq可以研究细胞内蛋白和靶RNA结合情况，包括lncRNA、miRNA等非编码RNA。
2. 利用Ago-RIP-seq可以研究Ago-miRNA-mRNA三者结合情况。
3. RIP-seq可以结合其他组学研究蛋白的某一特定功能，比如结合RNA-seq来研究RNA选择性剪接。
参考文献
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