看完这本蛋白质组学问题秘笈，都可说是学霸本人了（上）

话不多直接上秘籍

问题1

蛋白质谱鉴定不成功一般有哪些因素?

答：质谱鉴定不成功主要可以分为两类，一类是质谱效果不好，一类是没有可参考的蛋白数据库。质谱效果不好的原因又可以细分为蛋白点太淡以至于蛋白含量过低（常见银染的点）、蛋白酶解及质谱操作失误等。要避免这些因素需要尽量取颜色深一些的蛋白点，并且取的蛋白点面积需要适当大一些，对于某些很小但很清晰的蛋白点，取点的时候可适当选择孔径大一些的枪头，把边上空白处适当取到一些也不要紧，避免取点混入其他的蛋白点。其次，由于没有合适的数据库导致的鉴定效果较差，可以通过更换范围更大的数据库、近缘物种数据库、采用相关研究物种的蛋白、EST数据库等构建本地数据库的方式进行解决。

问题2

凝胶内的蛋白样品是否可以长期保存？

如何运输？

对质谱鉴定有何影响？

答：如果保存时间超过一周，可以将蛋白点切取后放入-20℃或者-80℃冰箱保存；如果小于一周，则可以常温保持，基本不会影响后续质谱鉴定效果，运送时常温快递即可。

问题3

iTRAQ/TMT技术相对于电泳技术有什么优势? 

答：2-DGE是伴随着MALDI-TOF技术发展起来的蛋白质分离技术，理论上可以通过等电点(IEF)和分子量(SDS-PAGE)的差异将总蛋白质逐一分开，实际情况并不理想，因为低丰度蛋白无法染色成功而看不见，蛋白翻译后修饰后偏离理论位置等等，一张2-DGE能鉴定到的蛋白质总数最多1000～2000蛋白。相较于2-DE以及DIGE等基于电泳的技术，iTRAQ/TMT分辨率高，博苑生物进行的细胞样品最多有发现超过6000个蛋白，并且绝大多数蛋白都有定量和定性信息；其次iTRAQ通量高，可以一次最多完成8个样品的实验，如果使用TMT技术最多可以一次完成10个样品的实验，特别适合于多组样品间的同时比较以及生物学过程的动态检测。最后，鹿明生物提供的iTRAQ完整实验服务中包括 iTRAQ/TMT 实验中鉴定到的所有蛋白的定性和定量结果、差异筛选结果、并且免费提供差异蛋白的维恩图分析、聚类分析、热图分析、GO、Pathway、蛋白互作等生物信息学分析内容以及中英文双语的分析报告，除此之外还可以根据客户的需求提供个性化的服务，免去了数据分析的烦恼。

问题4

iTRAQ/TMT实验的主要步骤有哪些，主要采用哪些仪器？

能得到什么数据及什么生物信息分析结果？ 

答：实验步骤包括：蛋白提取、浓度测定及SDS-PAGE凝胶检测，质检报告；蛋白酶解、同位素标记；一维色谱分离，冻干机冻干；高分辨LCMSMS质谱检测；搜库定性、定量分析；差异蛋白筛选，差异蛋白生物信息学分析；完整报告整理。

目前常用的仪器有：AB 5600 Triple TOF、Thermo Q Exactive Orbitrap；

数据分析包括：统计学分析（火山图、韦恩图、热图、聚类等）、GO富集、Pathway 通路分析、PPI网络分析。

问题5 

 iTRAQ/TMT实验的中 “组分” 或者 “SCX分级”代表什么？

答：iTRAQ/TMT实验对肽段进行的是2D-LC-MS，其中第一维的色谱分析主要采用的是SCX或者高pH值的HPLC对标记好的肽段混合样品进行初步分离,而将样品分离成10个组分，以此来达到降低每个组分中肽段样品的复杂程度，然后再将这十个组分分别在进行LC-MS，以便能达到更好的质谱鉴定效果。

问题6

对于iTRAQ下机的原始数据，使用什么软件进行质谱鉴定分析？

如何判断差异蛋白？

答：我们采用与Triple TOF 5600 plus配套的proteinpilot 5.0v。已经有大量使用该软件发表的蛋白质组相关文献，是一款被广泛认可的蛋白质组鉴定、定量软件。目前对于差异蛋白筛选的条件没有统一的标准，实际筛选过程中需要我们结果具体的实验结果进行灵活的变化，尽量控制每组的差异蛋白总数在200左右或者鉴定结果总蛋白数目的10%左右，比较有利于我们进行后续的生物信息学分析。一般可信蛋白筛选可以根据FDR、unused和unique peptide来进行筛选。对于定量差异蛋白的评判标准，一般按照Flod change和P-value 等值来进行筛选。

问题 7

蛋白质谱鉴定不成功一般有哪些因素?

没有全基因组测序的物种能否做蛋白质组？ 

答：目前已经有大量的物种完成了全基因组测序，并预测了相应的基因，未测序的物种可以通过近缘物种的基因序列作为数据库进行蛋白质组的研究，如果没有较好的近缘物种也可以使用稍大一些的属或者科的数据库进行检索。除此之外，如果研究人员做过转录组亦可以使用相关的数据建立本地库进行蛋白的质谱鉴定数据库。

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