读这篇你将收获以下问题的答案：
确认lncRNA的功能，怎样合理设计实验？antisense可能比敲除好，rescue的必要性
到底是调控元件在起作用，还是lncRNA作为RNA在起作用？怎样区分呢？看第3条
读文献，经常看到lncRNA分段敲，有时看到敲promoter，还有插入早期多聚腺苷酸化信号的（pAS, early polyadenylation signals），目的都是啥？看第2条
心急的小伙伴可直接拖到文末，看延伸思考
转载这篇2016年发布于23plus的文献深读《【Plus深读】lncRNA：不只是 RNA——三篇重磅发现齐解读》，已获得授权。
近日，来自美国 Broad Institute 的 Eric Lander 研究组，与加州理工学院的 Mitchell Guttman 研究组，在小鼠 ES 细胞中，研究了基因组上会产生 lncRNA 的 12 个位置，发现其中有 5 个会顺式地影响周围基因的表达，但其中没有一个是通过 lncRNA 的转录本 RNA 直接影响的；而是通过其类似于启动子的活性（enhancer-like activity）、转录过程、剪切过程，来调控附近基因的表达。此外，这也不是 lncRNA 特有的机制。他们也找到了 6 个编码蛋白的 DNA 也会通过这种方式影响周围基因的表达。这说明基因表达的顺式调控方式比我们想要的要更加复杂。基因之间的表达交流可能比我们想的更频繁。
以 lncRNA linc1536（又命名为 Bendr，即 Bend4-regulating effects not dependent on the RNA）为例，特异性地切除一个 allele 的 linc1536 的promoter，只会下调该 allele 上的 linc1536 的表达，同时也会、且只会下调同一条 allele 上的 Bend4 基因的表达（Bend4 位于 Bendr 3‘端 35kb 处，两者转录方向为“背对背”），而不影响另一条 allele 上的 Bend4 的 RNA 水平。（图1）
图 1 Allele-specifically 切除 linc1536 promoter 只会影响该 allele 的 Bend4 的 RNA 水平。左图为 DNA，虚线表示切除。右图为 RNA 水平。
类似地，研究者还 allele-specifically 切除了其它 12 个 lncRNA 的promoter，其中有 5 个会特异性地影响同一条 allele 上周围基因的表达。这种现象也不是 lncRNA promoter 特有的，allele-specifically 切除 6 个 protein coding genes 的 promoter，其中有 4 个会特异性地影响同一条 allele 上周围基因的表达。（图2）
图 2 Allele-specifically 切除 lncRNA or mRNA的 promoter，特异性地影响该 allale 上附近基因的表达。（左图，黑色为切除的 promoter 的位置，蓝色为附近被影响的基因。无蓝色区域则表示附近无基因受影响。右图，切除 promoter 后，该 RNA 及受影响的附近基因的 RNA 水平。）
这种顺式作用背后的可能的机制有 3 条：（1）这些 promoter 也是附近基因的调控元件；（2）这些 lncRNA/mRNA 的转录/剪切过程影响了周围的基因的表达（切除 promoter 后，转录与剪切不再发生，因此影响周围基因）；（3）这些 lncRNA/mRNA 的转录产物影响周围基因的表达。
为了验证这三种可能性，研究者主要采用三种策略来研究：（1）Promoter 切除（如上所述）；（2）在 lncRNA 的基因的不同位置插入早期多聚腺苷酸化信号（pAS, early polyadenylation signals），提前终止转录；（3）将 lncRNA 的 gene body 的不同区域切除。
而 Readout 是目的基因及附近 1Mb 区域内基因的 RNA 水平（Allele-specific RNA-seq）及 RNA Pol II 的结合水平（Allele-specific GRO-seq）。
对于 promoter 切除后，对附近基因具有顺式调控作用的 lncRNA, 研究者在其不同位置插入 pAS，以检测其 transcription 是否影响附近基因表达；如果影响，再将 lncRNA 的基因的不同区域切除，如果这对附近基因表达无影响，则说明这些 lncRNA 并不是依赖其 RNA 序列、RNA 空间结构实现对附近基因的调控——而应该是该 lncRNA 的转录过程本身，调控了附近基因的表达。
下面一一来看。
首先，对于 linc1536（又命名为 Bendr），promoter deletion 使其 RNA 信号消失，也使 35kb 外的 Bend4 的 RNA 水平下降 60% 左右，RNA Pol II 的结合也下降 60% 左右。而在 linc1536 promoter 下游插入 pAS，其 RNA 信号消失，但对 Bend4 的 RNA 水平无影响（图3）。这表明 linc1536 promoter 的顺式调控作用，不依赖于 linc1536 的转录，而是其 promoter 作为了 Bend4 的调控元件，发挥了类似于启动子的作用（我的分析详见延伸思考）。
图 3 linc1536 对 Bend4 的顺式调控依赖于 linc1536 promoter 的 enhancer-likefunction. （a）linc1536 与 Bend4 的基因组位置，RNA Pol II 结合信号，H3K4me3 信号。（b）左：基因编辑示意图；右：RNA水平。（c）Allele-specific RNA Pol II 结合信号。
而对于另一个 lncRNA，linc1319（命名为 Blustr，bivalent locus (Sfmbt2) is upregulated by the splicing and transcription of an RNA），切除其promoter，使 5kb 外的基因 Sfmbt2 的 RNA 水平下降 90% 左右。而在 promoter 下游插入 pAS ，使 linc1319 RNA 信号消失，也使 Sfmbt2 的 RNA 水平下降 90% 以上。这说明 linc1319 的转录也会调控 Sfmbt2 的表达。
那么到底是 linc1319 的 RNA 调控的，还是 linc1319 的转录过程调控的 Sfmbt2 的表达呢？研究者逐一切除了 linc1319 的 intron1,2,3 和 exon2,3,4，发现均不会引起 Sfmbt2 的表达下调。这说明 linc1319 对 Sfmbt2 表达的顺式调控作用，至少不依赖于 linc1319 的 RNA 序列与 RNA 空间结构——而它们是目前已知的 lncRNA 的 RNA 发挥作用的最关键因素。（图4）（我对 intron1 deletion 的分析见延伸思考。）
图 4 Linc1319 对 Sfmbt2 的顺式调控作用不依赖于 linc1319 的 RNA 序列。
这提示，linc1319 对 Sfmbt2 表达的顺式调控作用，很可能是通过 linc1319 的转录过程（包括剪切/splicing过程。转录与剪切是同时发生的；切除单个 intronor exon，剪切还是会继续发生），实现的。为了进一步验证，研究者依次在 linc1319promoter 下游的不同距离插入 pAS，让转录长度依次增加，然后发现 Sfmbt2 的 RNA 水平也随之依次上升。最远在 promoter 下游 15kb 处（intron1 内）插入 pAS，Sfmbt2 RNA 水平只降低 30% 左右。这说明 linc1319 的转录过程对 Sfmbt2 起到了顺式调节作用。
除了利用 pAS 插入法，研究者还采用切除剪切位点的方法。切除 linc1319的 5’ splice site 导致 linc1319 RNA 水平下降 90% 以上，也使 Sfmbt2 的 RNA 水平下降 80% 左右。也说明 linc1319 的转录过程对 Sfmbt2 起到了顺式调节作用。（图5）
图 5 Linc1319 的转录过程对 Sfmbt2 起到了顺式调节作用。
研究者认为，可能是 linc1319 的转录/剪切机器直接参与 Sfmbt2 的转录过程；也有可能是 linc1319 的转录过程，影响了 Sfmbt2 的染色质环境，使其处于激活的状态（确实看到抑制 linc1319 转录，Sfmbt3 promoter H3K27me3 上升，图 6.）。理论模型如图 7。
图 6 Linc1319/Blustr 的转录影响 Sfmbt2 的染色质环境
图 7 理论模型
最后，在进化上，研究者认为 lncRNA 不依赖于 RNA 的顺式调控机制，部分解释了为何 mESC 中表达的 lncRNA 大部分都不保守的问题：因为对这些 lncRNA 来说，其 RNA 序列的调控作用可能不再重要，而其作为调控元件的功能、其转录过程的顺式调控过程可能才是其主要的功能所在。研究者确实发现，人鼠非保守的 lncRNA，在人鼠的对应基因组区域都有相似的染色质修饰状态、染色质开放程度，mESC 中的小鼠特异表达的 lncRNA，很多在 human ESC 的对应位置都是调控元件。提示 lncRNA 的 RNA 序列可以不保守，但其顺式调控功能却可能保留了下来。
今年 10 月，Nature 报道了来自德州西南医学中心的 Eric Olson 研究组的发现。对胚胎心脏发育至关重要的 ancestral regulator——Hand2 的表达，也受到其上游的 lncRNA Uph 的转录的调控。在 E15.5 的小鼠胚胎中，Uph lncRNA 与 Hand2mRNA 共定位于心脏，舌头，下巴等位置。Uph 的 DNA 位于 Hand2 上游 150bp 处，长 16.5kb，转录方向与 Hand2 相反。
研究发现，用 antisense-oligo 敲低成熟的 Uph，并不影响 Hand2 的表达；在 Uph exon2 插入 random sequence 也不影响 Hand2 的表达；而在 Uph 的 exon2 插入 pAS，使其转录下调 97%，则会使 Hand2 的表达也下调 90% 以上，胚胎出现与切除 Hand2 相同的表型：右心室发育不良，胚胎致死。表明 Uph 的转录信号可能调控了 Hand2 的表达。（王司清：插入 pAS 的位点距离 Hand2 TSS 不到 1kb，此处还有很高的 H3K27ac 信号，有可能属于 Hand2 的 promoter。所以插入的 pAS 很有可能直接影响了 Hands2 的转录。）
图 8 lncRNA Uph 与 Hand2 的相对位置，共表达，与组蛋白修饰信号。
图 9 通过插入 pAS，切除 lncRNA Uph，导致 Hand2 表达明显下调。
今年4月，Molecular Cell 报道了来自 St. Jude Children’s Research Hospital的 Mitchell Weiss 研究组的发现。小鼠成红血细胞中高度表达的 lncRNA Lockd 的 promoter，也会调控上游 4kb 外的 Cdkn1b (p27) 的基因表达。
他们利用 CRISPR 删除 Lockd lncRNA gene（25kb） 会使 Cdkn1b RNA level 下降 70%；而如果在 Lockd lncRNA gene 的 TSS 下游 80bp 处插入 pAS，使其本身 RNA level 下调 90% 以上，则并不会对 Cdkn1b 的基因表达产生影响。
利用 3C，他们发现，lncRNA Lockd 的 promoter 与 Cdkn1b 的 promoter 有很强的相互作用，因此推测是 lncRNA Lockd 的 promoter 有 enhancer-like activity 调控 Cdkn1b 表达。（尽管 ChIP-seq 发现，他们的 promoter 区域有高 H3K4me3 水平、高 H3K27ac 水平、没有 H3K4me1、Lockd promoter 无 Gata1 binding； Gene body 有高 H3K36me3。是典型的 promoter 的特征，而非 enhancer 特征。）
图 10 Lockd lncRNA gene 对 Cdkn1b 的调控不依赖于 lncRNA 的 RNA。
图 11 Lockd 与 Cdkn1b 的 ChIP-seq 表明，其 promoter 为典型 promoter 特征。
图 12 3C表明 Cdkn1b promoter 与 Lockd promoter 有较强互作（绿线为 anchor 区，红线为互作区）。
1. 此前也有一些报道，提示了 lncRNA 的 DNA 作为 cis-element 的功能。如Xist DNA 可以 loops 到 X chromosome 的多个位置，或许有助于 Xist lncRNA 的扩散(1) 。印记基因 Igf2r 的表达，会受到反义链的 lncRNA Airn 的转录信号的抑制，此功能并不依赖于 Airn 的 RNA 本身(2)。Haunt lncRNA 的 RNA 会抑制 HOXA 的表达，但 Haunt 的 DNA 则对 HOXA 的激活有 enhancer-like activity，切除后会下调 HOXA 的表达(3)。
2. 以前研究 lncRNA 的作用，经常采用删除 lncRNA（或其 promoter）的做法。这样看到的表型，其实并不一定对应 lncRNA 作为 RNA 的功能，还有可能是其作为调控元件的作用，或其转录过程对其他基因的调控作用。所以，或许可以采用 antisense-oligo（ASO）, 产生 DNA-RNA double strand 与 RNaseH-mediated decay，在核内敲低 lncRNA，来进行研究。此外，还可以 rescue lncRNA（通过质粒，或者整合到基因组的其他位置产生核内 lnRNA）作为对照。
3. 本文对 eRNA 的研究也具有很好的启示作用：也许 eRNA 的序列并不是关键。它的转录信号才是关键。
4. 研究者认为，linc1536 promoter、Lockd promoter 都是通过 enhancer-like activity 调控富集基因，但是这些 promoters 都是 H3K4me3，无 H3K4me1 信号。从组蛋白修饰与 TFs 的 binding 来看，这更像是 promoter 而非 enhancer，这些 lncRNA 也不像是 enhancer RNA（gene body 富集 H3K36me3）。
我认为，promoter 可能存在成簇激活的情况，也许簇内的 promoter 的激活存在交流。如果切除簇内的启动子，可能会影响附近启动子的活性。也许 lnc1536 与 Bend4 的 promoter、Lockd 与 Cdkn1b 的 promoter 就是这种情况。值得注意的是 Bend4 的表达情况也受附近的另一个基因，Slc30a9 的 promoter deletion 的影响。也许他们都在一个 promoter cluster 中。可以利用 3C 检测两点间的空间互作，用 4C 检测 promoter cluster 的构成，然后进行功能验证。
5. 插入 pAS 是一个终止转录的好方法，但是，插入 pAS 后，招募的 poly-A 机器还是有可能影响染色质环境，进而影响周围的基因表达——这就不全是终止转录的影响了。我觉得另一个替代方案是，用 dCas9-UPF1 + gRNA 使 RNA Pol II 不能结合在目的区域上。
6. Eric Lander 研究组选取目标 lncRNA/mRNA 的选取很具有巧思。他们选取的 12 个 lncRNA 的标准是：
（1）Promoter 有 H3K4me3，gene body 有 H3K36me3——以此确定这是个典型的活跃转录的基因；
（2）通过基因表达的加帽分析（CAGE），找到有 TSS 的 lncRNA——以便于在 TSS 上下游的不同位置插入 pAS 序列（lncRNA 不能用起始密码子作为 TSS）；
（3）选取偏向于定位于核内的 lncRNA，定位于核内：胞质的比例大于 lncRNA的平均值 1.5——这些 lncRNA 有更大的可能性调控周围的基因，推测研究者本来想研究的是 lncRNA 作为 RNA 调控附近基因；
（4）目的 lncRNA 距最近的基因需大于 5kb。
而目的 mRNA，则是
（1）选取了 2 个表达量适中、认为不是 mESC 生长关键基因的 mRNA (Dicer1 和 Crlf3)。发现切除 promoter 不影响周围基因表达。
（2）选取了 2 个上文中选择的 lncRNA 旁边的 mRNA (Sfmbt2 和 Rcc1)——以检测目的 lncRNA 周围的 mRNA 是否也会影响周围的基因表达。发现这两个切除 promoter 会影响周围基因表达。
（3）选取 2 个上文中选择的 lncRNA 旁边的旁边的 mRNA (Gpr19 和 Slc30a9)——检测受影响的基因是否只相应于 lncRNA promoter deletion，还是也相应于 mRNA promoter deletion。后来发现如 Bend4 的表达，不仅受 linc1536 的 promoter deletion 的影响，也受 Slc30a9 promoter deletion 的影响。
7. 研究者的方案还是不能很好地区分转录机器与剪切机器，对附近基因的调控作用。如果可以特异性地抑制 lncRNA 的剪切，或者简单地去掉 lncRNA 内的 splice sites，或许可以进一步研究。
8. 切除 linc1319 中最长的片段：intron1，会提高 linc1319 的 RNA 水平至 614%，Sfmbt2 的 RNA 水平也会提高至 1592%。这可能是因为 linc1319 的转录过程更高效导致的，但也有可能是 linc1319 的 mature RNA 更多，通过 RNA 影响的。可以尝试在此情形下敲低 linc1319，检测是否下调 Sfmbt2 表达；在 WT 细胞中外源转入/过表达 linc1319，检测是否上调 Sfmbt2 表达。
此外，还可分析 linc1319 的 intron1 是否有repressive element的活性（如 CTCF binding 等）。
9. 切除一段 DNA 可能引起 chromatin structure 因 DNA 变短而产生的改变，进而影响附近基因表达。应该采用只破坏 promoter 的方式。比切除 DNA 更好的方式是，将其替换为等长的随机序列。
10. 如果文章可以结合染色质空间结构具体分析，则会更加细致。但由于选取的基因距离都非常近（5kb~35kb），用 HiC 还达不到如此高的分辨率。可以用 3C 进行逐一研究。
感谢 Siyuan Xu, Hongjie Shen 对本文的审阅与建议！
深读作者介绍
联系客服
