关于单细胞测序技术，我们已经连续介绍了3期了：
由于大家对这个技术比较关心，今天我们再发一期，这期我们讨论一个比较“敏感”的话题：发一篇Circulation的“预算”是多少?
其实“成本”这个概念不适合用在科研上，所以我们觉得“预算”可能相对比较合适，即：如果老板想让你发一篇Circulation的文章，你们至少需要准备多少的“预算”？至于为什么说至少，大家应该明白的，科研本身就是探索性的工作，如果结果都能像预期的话，我们早就攻克癌症了。所以这里说的“预算”只是我们根据外面的服务公司的“市场价”推算出来的，至于一个WB实验重复8遍图片还不漂亮等等没法估量的“成本”，我们就不计算了，大家也别较真。所以下面计算成本的前提是：心灵手巧、运气逆天的你所有实验都一次性成功！
好，下面我们先看文章的思路，再计算“成本”。文章2018年1月份发表在Circulation杂志上：
Single-Cell Sequencing of the Healthy and Diseased Heart Reveals Ckap4 as a New Modulator of Fibroblasts Activation.Circulation 2018 Jan 31
文章的研究主题是通过单细胞测序发现Ckap4作为成纤维细胞活化的新调控因子。
具体来看，由于在做单细胞测序时组织来源活性细胞的分离是一个技术难点，文章首先优化了小鼠心脏组织中活细胞分离和获取RNA的技术（下图1）：
图1
结果发现分离的活细胞比例在89%左右（C），而RNA提取的质量也是过关的（E图）。
接下来就是对正常和缺血再灌注损伤的小鼠心脏组织中分离的细胞及RNA进行单细胞测序了，我们先看正常小鼠心脏做的单细胞测序结果（图2-图4）：
图2
在图2中，研究团队对三个正常小鼠心脏组织中的426个细胞进行测序，然后通过K-medoids聚类（A）和t-SNE（B）分析发现了归属于四类细胞（C）的14个细胞亚群（Cluster），其中1，3，4和9属于心肌细胞，6和13属于成纤维细胞，5和7属于内皮细胞，8和14属于巨噬细胞。接下来的通过t-SNE分别展示了这四类细胞的标志物（marker基因）表达（D图）。
图3
接下来研究团队重点关注心肌细胞中的四个亚群，A图展示的是每个亚群中表达最高的前25个基因，黑色的是marker基因；B图展示的是marker基因在亚群中的情况；C图是用热图展示已知心肌细胞marker基因在四个亚群以及成纤维细胞中的表达情况，我们可以看到，在四个亚群中，亚群4与其它三个亚群的差异最为明显。所以下面就进一步对亚群4进行研究（大家看一下这个cluster在t-SNE图中的位置）。
图4
最后发现心肌细胞的亚群4却不表达一些常见marker（A中的Tnnt2），却能够高表达Myoz2（B）；C图展示的是小鼠心脏组织的TNNT2和MYOZ2免疫染色；而D则是对亚群4中上调和下调最高的200个基因进行GO注释的结果，从D图和E图我们看到上调的基因功能主要是神经退行性疾病，而下调的基因功能主要是心脏疾病。
以上讲的是正常心脏组织的单细胞测序结果，我们简单总结一下就是：先优化了组织活细胞分离和RNA提取的方法，然后单细胞测序发现了心脏组织中的四类细胞，在14个亚群中有4个亚群中的细胞属于心肌细胞这一类，其中亚群4与其它的三个亚群不同，亚群4特异性的高表达MYOZ2基因。
下面我们看缺血再灌注损伤疾病下细胞的测序和结果。
图5
首先用同样的方法，研究团队通过单细胞测序检测了509个缺血再灌注损伤细胞的基因表达，并与正常的426个细胞结果一起进行分析，结果共找到了17个细胞亚群（B图）。接下来重点关注与缺血再灌注损伤有关的成纤维细胞：共有7，13和15三个成纤维细胞亚群（D图），Marker基因表达的t-SNE图见E，F图展示的是对这些基因表达的qPCR验证，其中亚群7在正常和缺血再灌注损伤模型里面都有，而亚群13和15则在则主要在损伤模型中存在，接下来就是展示差异基因、功能注释等的情况了（G-H）。
接下来，引出了文章的一个在活化的成纤维细胞中高表达的关键基因Ckap4，并通过常规测序（bulk RNA-seq）进行了验证（J图），K和L的图是展示的Ckap4在7，13和15三个亚群中的表达。
图6
然后，对Ckap4进行细胞水平的免疫染色（A），以及在TGFβ刺激的细胞中对Ckap4进行沉默后对marker蛋白的影响（B-E）。
图7
最后是Ckap4基因与marker基因在病人组织表达的检测和相关性分析。
好了，文章的思路就介绍到这里，我们再理一下：前面发现性的工作主要是从动物模型上做的，包括了正常和缺血再灌注损伤两组的6个组织，共分离了509和426个细胞进行单细胞测序，在正常组织中获得了14个细胞亚群，关注的亚群4特异性的高表达MYOZ2基因；在对正常和缺血再灌注损伤进行联合分析时，关注的是成纤维细胞的13和15两个在疾病组特异性升高的亚群，这两个亚群高表达Ckap4基因。在验证工作上，包括了细胞层面Ckap4对成纤维细胞marker的表达，以及组织样本上与marker蛋白的表达相关性。从文章的结果展示来看，t-SNE图出现的频率非常高，这也是单细胞测序分析里面最常见的分析结果。
最后，我们根据“市场报价”大体上计算一下这篇文章的“花费”：
单细胞测序部分：6个小鼠组织*5万（一个样本按照5万计算）=30万
常规测序：6个样本*2000=1.2万；
细胞部分的实验大约8万；
动物部分的实验大约10万；
临床部分的指标检测大约2.8万；
这样算下来大约在52万，你可以乘以一个系数2，也就是说大约要100万了。
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