在美国医学遗传学和基因组学学会（ACMG）的年会上，测序公司Invitae的生物信息学家Steve Lincoln表示，新一代测序（NGS）有时难以检测到某些复杂的变异，这强调需要更好的标准来确保NGS基因检测的质量。
这项研究结果涉及到7个实验室的10种流程。他们发现，NGS很难检测到患者样本中发现的许多致病变异，包括大的插入缺失（indel）、拷贝数变异、均聚物或结构变异。许多实验室也没有用足够数量的样本对NGS检测进行验证，部分原因是阳性对照样本很难获得。
作为替代方案，研究人员决定使用合成的参考样本，它们代表了不同类型的变异。在设计这种所谓的“Frankencontrol”时，他们选择了7个经常检测的癌基因中的24种变异，包括BRCA1、BRCA2、CDKN2A、MLH1、MSH2、MSH6和PMS2，其中许多是致病性的。
他们分析了17种在技术上具有挑战性的变异，其中包括小的、中的和大的插入缺失；短串联重复序列中的缺失；串联重复扩增；均聚物相关变异；删除/插入（delin）变异；片段重复中的变异；GC富含区域中的变异；插入缺失附近的单核苷酸变异（SNV）；以及良性的SNV。
SeraCare生命科学公司合成了含有这些变异的质粒，并将其掺入一些细胞系的基因组DNA中，使它们看起来像杂合性的。然后将这种参考样本提供了7家合作的实验室。
这些实验室采用10种检测流程，其中八种涉及到Illumina测序平台，并结合各种靶向捕获方法；一种使用Illumina全基因组测序；另一种则使用赛默飞的Ion Torrent平台和AmpliSeq靶向扩增。所有的流程都使用不同的生物信息学方法，其中两个经过临床验证。
所有10种检测流程都能够检测到“简单”的SNV和小的indel，只有一个实验室错过一个小的indel。 然而，只有10个挑战性的变异被所有流程检测到，且只有三个流程检测到所有17种复杂变异，包括Invitae的检测流程。Lincoln指出，许多变异实际上都存在于原始的NGS数据中，但被生物信息学分析错过。
Ion Torrent流程未能检测到多种变异，因为AmpliSeq方法无法扩增一些等位基因。Lincoln解释说，AmpliSeq是针对FFPE样本而优化的，依赖于小的扩增子，每个目标只被一个引物对覆盖，因而导致失败。此外，Ion Torrent平台还错过了均聚物相关的变异，这是一个已知的问题，不过Illumina的三种检测流程也错过了其中一种变异。
Lincoln评价说，瑞迪儿童医院（Rady Children's Hospital）的Illumina全基因组测序流程的表现“出乎意料地好”，尽管实际上它在所有检测中的覆盖率最低，但只缺少三种变异。
Lincoln认为，临床实验室可能会忽视这个问题，同时实验室也需要更好的标准材料。 SeraCare现在提供商业研究中使用的合成参考样本，但需要其他公司开发更多的标准材料。
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