满足polyA富集不适用的情况
（非编码RNA等研究）
今天继续介绍接下来的建库方法
——链特异性文库构建
什么叫链特异性(Stranded)？
这需要复习一下高中生物
分子生物学的基石：中心法则
双链DNA为模板转录成单链RNA
然后RNA翻译成蛋白质
还有复制和逆转录哔哩吧啦...
今天只关注第一句话
双链DNA为模板转录成单链RNA
也就是说双链DNA中
只有其中一条链作为模板转录
而之前介绍的常规RNA-seq建库
反转录合成的cDNA是两条链
这又有什么关系呢？
当然有！！！
基因组区域存在正负链转录
真核生物的基因反义转录
就是一种重要的调控方式
而原核及低等真核生物基因组
常常具有重叠基因
因此区分转录本来自正负链
对于后期数据分析至关重要 ！
而测序仪只能测双链DNA
不能测单链RNA
普通RNA测的是双链cDNA
就不能区分出正义链和反义链
链特异性测序便出现了
在构建测序文库时保留
RNA链的方向信息
数据分析来确定转录本正负链
与普通转录组测序相比
更准确地统计转录本的数量
并确定基因的结构，还有
发现新的反义转录本/基因...
链特异性转录组测序关键
在于构建链特异性文库
最常用的方法是掺U法 ，即
先从RNA逆转录第一链cDNA
合成第二链时用dUTP代替dTTP
使第二链中掺入大量U碱基
接头连接后用USER酶进行消化
USER酶是一个混合酶
尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)
把U碱基进行糖基化
接着糖基化的U被切掉
这样核酸链上就型成一个空位
核酸内切酶VIII会降解核酸链
双链的文库就只剩下了一条链
而两端连有不同序列的接头
PCR扩增文库保有不对称接头序列
后续测序的就是有方向的文库了
链特异性的优点还挺多的
基因表达定量更精确
可变剪切检测更准确
非编码转录本的检出率增高
新转录本预测更真实
满足原核生物操纵子分析
模式生物基因深度分析
今天放假有点癫狂
所以表情泛滥了
就不贴protocol快照了
省的有童鞋质疑打广告
其实这提醒了鄙人
等和老总谈好了广告费再说
PS：如果自建库成本低，为了实验不从头再来，为了发优质文章，其实应该果断选择“链特异”，也避免了自己忙活半天竟然没有测到期待的结果！
希望今天的内容能够帮到大家
后续内容更精彩
敬请期待！！！
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