cell子刊：TCGA数据挖掘了可变剪接位点产生潜力的突变

  在过去的十年中，癌症基因组研究集中于导致剪接位点破坏的突变，忽略具有剪接创造潜力的突变。在这里，我们应用了一种生物信息学工具，用于在8,656个TCGA肿瘤中大规模发现剪接位点产生突变（SCMs），文章几乎没做实验。

文章概况：

通过生信工具分析，利用TCGA泛癌数据识别1,964个产生剪接位点的突变。

26％和11％的可变剪切位点曾被误注为错义和沉默突变。

SCMs可能比错义突变更具免疫原性

剪切创造突变的发现

（A）用于不同常规注释的突变类型的剪接位点产生突变的实例。 Splice-in被定义为新创建的外显子中包含的突变，SPlice-out拼接出现在新创建的内含子中存在突变。

(B) 工作流程由三个步骤组成：替代联合发现，过滤和手动审查。 首先，用户输入RNA-seq BAM文件的位置以及突变文件。 搜索BAM文件以确定感兴趣突变附近的任何替代剪接点，同时筛选已知剪接点并计算病例和对照样本的替代结点支持读取的数量。 对于过滤步骤，删除以下位点：HLA基因中的突变，支持替代剪接点的读数的低部分，以及在对照中表达的位点。 最后，我们手动审查所有网站通过计算机预测位点。

（C）通过常规注释分解2,056个手动验证的剪接位点创建突变。

SCMs的分子和生物模式

（A）产生剪接位点的突变相对于新产生的剪接点的频率分布，在新创建的内含子的第三个核苷酸位置显示高频率。

（B）比较新创建的剪接位点，之前（参考）和突变之后（突变体）的剪接评分。显示了内含子中第三核苷酸位置处的突变（尤其是3'剪接位点）的较大影响。

（C）在3'剪接位点-3位上产生剪接位点突变的显性核苷酸序列环境。突变位置（红点）与新创建的外显子相距3个碱基对。

（D）3'剪接位点-3位置的转换和颠换率。大多数突变是G> C颠换，增强剪接因子U2AF1的共有序列。

(E)比较最近的带和不带突变的标准剪接接头与新创建的有突变和无突变的剪接接头之间的剪接得分。相对于典型的剪接结，大多数突变增强了可选的剪接连接。

剪切位点创造突变结合等位分数

为了量化这种效应，我们测量了选择性连接表达作为选择性剪接连接跨越读数的分数超过基因组位置处的总读数。

（A）结合等位基因分数（JAF）被定义为支持交替拼接连接的读数相对于总连接跨越读数的数量。按常规注释类型分隔的JAF值的分布。

（B）通过常规注释类型比较JAF与DNA变体等位基因分数（VAF）的比较。大多数突变类型显示JAF和VAF值之间通常呈正相关。

（C）剪接位点创建突变表达在新创建的替代剪接点的外显子。突变位置相对于支持选择性连接和突变的阅读百分比（拼接入JAF）的比较。每个位置的平均值由黑点突出显示。对于所有位置而言，剪接位点产生突变和替代剪接位点之间存在强相关性。

跨基因和癌症类型可变剪切

（A）每个基因中剪接位点产生突变的分布由每个基因中的总突变数分开。 TP53具有最大数量的剪接位点产生突变，其次是GATA3和ATRX。

（B）具有最高数量的pancancer剪接位点产生突变的基因。圆圈大小与每个基因的突变总数（圈内标记）相关，并且与癌症类型相关。TP53中的剪接位点产生突变存在于许多癌症类型中，而ATRX和GATA3中的突变分别对LGG和BRCA特异。

（C）蛋白质永恒（PAB结构域）和PARP1（链A）分别着色为绿色和粉红色。在PARP1（链A）上突出显示最初注释的p.S939S突变（红色）和剪接出的序列（蓝色）。

（D）与抑制剂（PDB ID：5WRQ）复合的PARP1的3D蛋白质结构。药物抑制剂和PARP1（链A）分别用绿色和粉红色表示。

剪接位点创建突变的功能分析

(A)整合基因组观察器(IGV)对第21外显子中PARP 1中的传统注释同义突变的截图。

(B)BAP 1的候选重复剪接位点产生突变。通常被注释为同义变体的BAP 1突变区域显示IGV屏幕截图中的剪接读取(红色读取)，每个示例都带有剪接站点创建的突变。

（C）在外显子2中RAD51C中常规注释的同义突变的IGV屏幕截图。

(D)剪接位点产生变异体在(紫色)之前和之后(红色)对在微基因剪接试验中经功能验证的每个变异体引入的变异体的最大熵分数。在硅芯片的预测表明，所有的突变加强了可选的剪接位点。

(E)候选剪接位点创造突变，经微基因剪接分析验证。将感兴趣的外显子克隆到pCAS2.1载体和突变体(RED)中，将野生型(紫色)质粒转染293 T细胞，提取总RNA，鉴定突变诱导的交替剪接产物。

GATA3剪接位点创建突变和新抗原预测的示意图

PD-L1，PD-L2，PD-1，CD8A和CD8B表达