三代组装真的考验计算资源，我用20线程在correct这一步跑了整整3天，而一个小伙伴用超算，26node x 28 cpu, 6个小时搞定。
Canu是Celera的继任者，能用于组装PacBio和Nanopore两家公司得到的测序结果。
Canu分为三个步骤，纠错，修整和组装，每一步都差不多是如下几个步骤：
加载read到read数据库，gkpStore
对k-mer进行技术，用于计算序列间的overlap
计算overlap
加载overlap到overlap数据库，OvlStore
根据read和overlap完成特定分析目标
read纠错时会从overlap中挑选一致性序列替换原始的噪声read
read修整时会使用overlap确定read哪些区域是高质量区域，哪些区域质量较低需要修整。最后保留单个最高质量的序列块
序列组装时根据一致的overlap对序列进行编排(layout), 最后得到contig。
这三步可以分开运行，既可以用Canu纠错后结果作为其他组装软件的输入，也可以将其他软件的纠错结果作为Canu的输入，因此下面分别运行这三步,并介绍重要的参数。
几个全局参数：genomeSize设置预估的基因组大小，这用于让Canu估计测序深度； maxThreads设置运行的最大线程数；rawErrorRate用来设置两个未纠错read之间最大期望差异碱基数；correctedErrorRate则是设置纠错后read之间最大期望差异碱基数，这个参数需要在 组装 时多次调整；minReadLength表示只使用大于阈值的序列，minOverlapLength表示Overlap的最小长度。提高minReadLength可以提高运行速度，增加minOverlapLength可以降低假阳性的overlap。
Canu的软件安装不难，这里就不赘述了。
如果你的软件安装还没有过关，你可能还不适合学习这篇文章，我建议你先去腾讯课堂学习我录制的 生信必修课之软件安装
数据来自于发表在 Nature Communication 的一篇文章 “High contiguity Arabidopsis thaliana genome assembly with a single nanopore flow cell”。 这篇文章提供了 Arabidopsis thaliana KBS-Mac-74 的30X短片段文库二代测序、PacBio和Nanopore的三代测序以及Bionano测序数据, 由于拟南芥的基因组被认为是植物中的金标准，因此文章提供的数据适合非常适合用于练习。根据文章提供的项目编号”PRJEB21270”, 在European Nucleotide Archive上找到下载地址。
## PacBio Sequal
wget -c -q ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/ERA111/ERA1116568/bam/pb.bam
## MinION
wget -c -q ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/ERA111/ERA1116595/fastq/ont.fq.gz
# Illuminia MiSeq
wget -c -q ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/ERA111/ERA1116569/fastq/il_1.fq.gzwget -c -q ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/ERA111/ERA1116569/fastq/il_2.fq.gz下载的PacBio数据以BAM格式存储，可以通过安装PacBio的smrtlink工具套装，使用其中的bam2fasta工具进行转换
# build index for convert
~/opt/biosoft/smrtlink/smrtcmds/bin/pbindex pb.bam &
# convert bam to fasta
~/opt/biosoft/smrtlink/smrtcmds/bin/bam2fasta -o pb pb.bam &PacBio的smrtlink工具套装大小为1.4G，不但下载速度慢，安装也要手动确认各种我不清楚的选项, 唯一好处就是工具很全。
第一步：纠错。三代测序本身错误率高，使得原始数据充满了噪音。这一步就是通过序列之间的相互比较纠错得到高可信度的碱基。主要调整两个参数
corOutCoverage: 用于控制多少数据用于纠错。比如说拟南芥是120M基因组，100X测序后得到了12G数据，如果只打算使用最长的6G数据进行纠错，那么参数就要设置为50(120m x 50)。设置一个大于测序深度的数值，例如120，表示使用所有数据。
canu -correct \ -p ath -d pb_ath \ Threads=10 gnuplotTested=true\ genomeSize=120m minReadLength=2000 minOverlapLength=500\ corOutCoverage=120 corMinCoverage=2 \ -pacbio-raw pb.fasta.gz可以将上述命令保存到shell脚本中进行运行, nohup bash run_canu.sh 2> correct.log &.
注: 有些服务器没有安装gnuplot, gnuplotTested=true 可以跳过检查。
第二步：修整。这一步的目的是为了获取更高质量的序列，移除可疑区域（如残留的SMRTbell接头).
canu -trim \ -p ath -d pb_ath maxThreads=20 gnuplotTested=true\ genomeSize=120m minReadLength=2000 minOverlapLength=500\ -pacbio-corrected ath/pb_ath.correctedReads.fasta.gz第三步: 组装。在前两步获得高质量的序列后，就可以正式进行组装. 这一步主要调整的就是纠错后的序列的错误率， correctedErrorRate，它会影响utgOvlErrorRate。这一步可以尝试多个参数，因为速度比较块。
# error rate 0.035
canu -assemble \ -p ath -d ath-erate-0.035 \ maxThreads=20 gnuplotTested=true \ genomeSize=120m\ correctedErrorRate=0.035 \ -pacbio-corrected atg/pb_ath.trimmedReads.fasta.gz
# error rate 0.050
canu -assemble \ -p ath -d ath-erate-0.050 \ maxThreads=20 gnuplotTested=true \ genomeSize=120m\ correctedErrorRate=0.050 \ -pacbio-corrected atg/pb_ath.trimmedReads.fasta.gz最后输出文件下的ath.contigs.fasta就是结果文件。
官方文档: https://canu.readthedocs.io/en/latest/index.html
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