HiC数据分析实战（一）

首先需要明白数据分析流程，可以查看第一讲：三维基因组学习笔记，提炼流程如下：

• Hi-C标准分析流程(比对及过滤，原始互作图谱构建)

• 下载参考基因组及构建bowtie2索引

• 把fq测序数据比对都参考基因组

• 过滤及挑选符合要求的比对结果

• 原始互作图谱构建

• 互作图谱迭代校正

• Compartment分析

• TAD分析

• 显著互作Loops分析

实战数据

来自于Tung B. K. Le et al. Science 2013 ：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=srr824846

Study: High-resolution mapping of the spatial organization of Caulobacter crescentus chromosome by chromosome conformation capture in conjunction with next-generation sequencing (Hi-C)

数据下载后转为fq文件如下：

858M Jul  3 16:21 SRR824846_Q20L10_1.fastq.gz
857M Jul  3 16:22 SRR824846_Q20L10_2.fastq.gz


如果想看其它数据：PRJNA196826 · SRP020913 · All experiments · All runs

下载参考基因组并且构建bowtie2的索引

物种是：新月柄杆菌 Caulobacter crescentus，它是一种经常用于实验室实验中的细菌，通常含有扁平囊泡（绿色），包裹着贮存颗粒（橙色）。

WC Nierman - ‎2001的文章就发表了该物种的基因组 - ‎被引用次数：500 The complete genome sequence of Caulobacter crescentus was determined to be 4,016,942 base pairs in a single circular chromosome encoding 3,767 genes.

mkdir -p ~/project/hic/ref
cd ~/project/hic/ref
wget ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/bacteria/release-40/fasta/bacteria_20_collection/caulobacter_crescentus_na1000/dna/Caulobacter_crescentus_na1000.ASM2200v1.dna.toplevel.fa.gz
gunzip Caulobacter_crescentus_na1000.ASM2200v1.dna.toplevel.fa.gz
bowtie2-build  Caulobacter_crescentus_na1000.ASM2200v1.dna.toplevel.fa   bacteria


得到

5.3M Jul 25 19:28 bacteria.1.bt2
988K Jul 25 19:28 bacteria.2.bt2
  17 Jul 25 19:28 bacteria.3.bt2
988K Jul 25 19:28 bacteria.4.bt2
5.3M Jul 25 19:28 bacteria.rev.1.bt2
988K Jul 25 19:28 bacteria.rev.2.bt2


这个参考基因组fa文件节选如下：

>Chromosome dna:chromosome chromosome:ASM2200v1:Chromosome:1:4042929:1 REF
GAATTCTTAACGTCCTGAGACACGACAGCGACCTCTGACCGGACTCGTTCCGCGTCTTTG
GACAATCGGGATTCAGACTTCGGGGGATGCGGCGCAGGCTTGGGGATGATAGGCGAGCAA
TGCGACCGTTGATCACAGCGGCGCCGTGTCACGACGCTGTTGGGGCCGTTCGGCGCCCGG


下载必备软件

软件大全来源于：https://omictools.com/3c-4c-5c-hi-c-chia-pet-category

如果没有conda就先安装咯：

wget https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
bash Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
source ~/.bashrc
conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/pkgs/free
conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/cloud/conda-forge
conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/cloud/bioconda
conda config --set show_channel_urls yes


然后安装一系列软件哈：

conda create -n hic  python=2 bowtie2
conda info --envs
source activate hic
conda search hiclab
conda install -y sra-tools samtools 


有些软件不在conda里面，需要自行查看软件说明书文档，主要是：

• https://bitbucket.org/mirnylab/hiclib

• https://github.com/nservant/HiC-Pro

其中特别值得推荐，可以处理各种各样的hic数据，包括：

• Hi-C

• in situ Hi-C

• DNase Hi-C

• Micro-C

• capture-C

• capture Hi-C

• HiChip

安装hiclib代码如下：

source activate hic
conda install numpy scipy matplotlib h5py cython numexpr statsmodels  scikit-learn pandas 
pip install https://bitbucket.org/mirnylab/mirnylib/get/tip.tar.gz
pip install https://bitbucket.org/mirnylab/hiclib/get/tip.tar.gz ##  17.7MB 44kB/s


安装hiclib代码如下：

# conda install numpy scipy matplotlib h5py cython numexpr statsmodels  scikit-learn pandas
## 依赖软件比较多
source activate hic
conda install -y pysam bx-python numpy scipy 
conda install  -y R  

R -e 'install.packages(c('ggplot2','RColorBrewer') repos='https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/CRAN/')'
R -e 'library(ggplot2)'
R -e 'library(RColorBrewer)'

mkdir -p ~/biosoft/hicpro
cd ~/biosoft/hicpro
git clone https://github.com/nservant/HiC-Pro.git
cd HiC-Pro/
which bowtie2
which R
which samtools
which python
cat config-install.txt
mkdir /home/zengjianming/biosoft/hicpro/bin


这个时候一定要根据自己的系统环境，修改目录下的config-install.txt文件哦：

PREFIX =/home/zengjianming/biosoft/hicpro/bin
BOWTIE2_PATH =/home/zengjianming/miniconda3/envs/hic/bin/bowtie2
SAMTOOLS_PATH =/home/zengjianming/miniconda3/envs/hic/bin/samtools
R_PATH =/home/zengjianming/miniconda3/envs/hic/bin/R
PYTHON_PATH =/home/zengjianming/miniconda3/envs/hic/bin/python
CLUSTER_SYS =SGE


然后就可以编译自己的软件啦：

make configure
make install


依赖非常多，但是用心安装还是问题不大的哦！

/home/zengjianming/biosoft/hicpro/bin/HiC-Pro_2.10.0/bin/HiC-Pro -h


这样如果输出了帮助文档，说明安装成功哦。

hiclib教程

先看官网readme，如下:

• 0. Download software and data

• 1. Map reads to the genome

• 2. Filter the dataset at the restriction fragment level

• 3. Filter and iteratively correct heatmaps.

打开才发现，居然清一色的python代码，而不是打包好的软件，命令行加上参数的模式来走这个流程，感觉有点难用，先放弃，后续再更新这个使用记录。

Hic-pro教程

其说明书完全不逊于hiclib，详见：http://nservant.github.io/HiC-Pro

大体上看就6个步骤，比对、过滤HiC比对结果、检测有效HiC序列、结果合并、构建HiC关联图谱以及关联图谱标准化。而行使这些不同功能只需要更改参数即可：

 [-s|--step ANALYSIS_STEP] : run only a subset of the HiC-Pro workflow; if not specified the complete workflow is run
      mapping: perform reads alignment - require fast files
      proc_hic: perform Hi-C filtering - require BAM files
      quality_checks: run Hi-C quality control plots
      merge_persample: merge multiple inputs and remove duplicates if specified - require .validPairs files
      build_contact_maps: Build raw inter/intrachromosomal contact maps - require _allValidPairs files
      ice_norm : run ICE normalization on contact maps - require .matrix files


只使用s 参数才会分步运行，因为5步中还是mapping花的时间最多，如果其它步骤需要调整参数，分步运行还是会快很多，比如调整BIN_SIZE等等。

当然，不得不提的是其特色功能：位基因特异性HiC分析

今天有点晚了，明天继续实战哦。

其它实战数据集

上面的是细菌基因组，测序文件也小很多，适合练手，如果熟练了也可以找其它数据集，比如Rose基因组的HiC原始数据下载地址：

• http://sra-download.ncbi.nlm.nih.gov/srapub/SRR6189546

• http://sra-download.ncbi.nlm.nih.gov/srapub/SRR6189547

每个数据都12G左右。

还可以是 An Osteoporosis Risk SNP at 1p36.12 Acts as an Allele-Specific Enhancer to Modulate LINC00339 Expression via Long-Range Loop Formation 文章的数据，等等。