从临床疾病的landscape或atlas构建到实验室每一个具体的研究项目，单细胞基因测序（Single Cell Sequencing）技术逐渐影响着生物医学研究的方方面面。肿瘤的异质性揭示：针对肿瘤组织总体水平的研究可能掩盖掉一些恶性的肿瘤亚群特征，单细胞RNA测序技术可以从单个细胞转录水平、基于PCA (principal component analysis)和t-SNE (t-distributed stochastic neighbour embedding )等常见的降维算法将混合细胞分群；通过分析不同亚群细胞的特征性基因，探索肿瘤、非肿瘤类的其他疾病或非疾病状态下一些生命科学现象的分子机制。我们相信单细胞测序技术必将应用到生物医药领域的各个研究方向，未来也可能真正应用于临床实践中。
年龄所致的慢性炎症是衰老的一个重要标志，但其对特定细胞的影响尚不清楚。成纤维细胞存在于大多数组织中，有助于伤口愈合。同时，它也是应用最广泛的诱导多能干细胞(iPS)重编程的细胞类型，对再生医学和再生策略有重要意义。2019年10月23日发表在 《Nature》的一篇题为“Heterogeneity in old fibroblasts is linked to variability in reprogramming and wound healing”的文章，作者利用单细胞RNA-seq技术（single-cell RNA sequencing）确定了老年小鼠伤口愈合中发挥不同作用的成纤维细胞亚群，它们具有不同的细胞因子表达和信号转导机制。我们一起来就看看这篇研究。
研究解决什么科学问题？
研究需要解决的问题是：年龄是否影响成纤维细胞（fibroblast）炎症特征及其iPS（induced pluripotent stem）细胞重编程能力？成纤维细胞亚群构成在伤口愈合中的作用是怎样的？
研究采用的模型
研究采用3个月青壮年小鼠和28-29个月老年小鼠耳部的fibroblast作为研究模型，分别检测小鼠血浆、原代成纤维细胞培养基、原代成纤维细胞iPS细胞培养基中细胞因子的表达谱（图1）。
图1. 单细胞测序实验模型设计及样本来源
研究发现了什么？
发现老年小鼠无论是血清或fibroblast来源样本的细胞因子表达均显著高于青壮年小鼠（图2）。
图2. 上：年龄依赖的不同种类细胞因子（促炎因子、抗炎因子、趋化因子、生长因子）在3种不同样本中的表达水平。ND：未检出。下：年龄对原代小鼠成纤维细胞条件培养基中细胞因子表达谱的影响。MFI：平均荧光强度。
单细胞测序发现老年小鼠的fibroblast表现出更多的炎症激活状态且与细胞的重编程能力相关（图3）。
图3. 来源于青壮年小鼠、老年小鼠（根据诱导重编程效率分为Good old、Bad old1、Bad old2 3组）成纤维细胞的PAGODA（pathway and gene set overdispersion Analysis）聚类分析
尽管伤口中位愈合率不受年龄的影响，但年老小鼠之间的伤口愈合率变异却增加了，和年轻小鼠相比，有些年老小鼠的伤口愈合速度快，有些则慢（图4）。
图4. 不同分组（年轻、年老愈合快、年老愈合慢）小鼠的伤口愈合实验（检测不同时间点伤口面积、记录愈合时间）
由于活化的THY1+PDGFRα+成纤维细胞本质上较非活化状态的THY1−PDGFRα+ 成纤维细胞重编程效率低。本文接着探索活化的成纤维细胞是如何影响重编程效率的，通过单细胞RNA-seq进一步分析发现：不同的fibroblast亚群比例在年轻和年老小鼠中是不一样的（图5）。
图5. 流式分选小鼠创伤模型组织中重编程能力较强的PDGFRα+Lin− 非活化成纤维细胞，单细胞测序分析成纤维细胞的亚群比例
为了明确创口边缘的细胞组成特征，通过单细胞RNA-seq技术分析年老快速愈合和年老慢速愈合的小鼠伤口边缘细胞的构成情况，发现愈合缓慢的老年小鼠的伤口中成纤维细胞含量更高，而愈合快的老年小鼠的伤口中免疫细胞含量更高（图6）。
图6. 流式分选愈合好、愈合差小鼠创口边缘活细胞，单细胞测序分析2组细胞亚群分类情况
综上，单细胞测序技术可助力科研工作者解决一些实际性问题，如本文发现衰老与小鼠体内细胞重编程和伤口愈合的变异性增加有关，发现炎性细胞因子（如：TNF）是影响重编程效率的关键因素等。
成纤维细胞是老年人慢性炎症的一个重要来源，可促进免疫细胞的募集。活化的成纤维细胞(增殖)和老化的成纤维细胞（表现出细胞周期的永久停滞）分泌部分重叠但不完全相同的细胞因子。细胞因子之间可能以复杂的方式相互作用，最终影响细胞的重新编程和创伤愈合能力。伤口愈合对老年人来说至关重要，有缺陷的伤口愈合（可导致溃疡）或过度的伤口愈合（可导致纤维化）均会不同程度地损害老年人的健康。随着年龄的增长，成纤维细胞亚群、细胞因子的组成变化可能导致伤口的愈合不良。这也为创伤患者的个体化治疗提供了新的策略，以有效地促进老年人的创伤愈合。
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【参考文献】
Heterogeneity in old fibroblasts is linked to variability in reprogramming and wound healing. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1658-5. Nature | Vol 574 | 24 OCTOBER 2019.
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