心血管病学进展2007年第28卷第4期
迟东升 阮新民 综述 陈可冀 审校
(广州中医药大学第二临床医学院心脏中心, 广东 广州 510105)
血栓和栓塞性疾病严重威胁着人类的生命与健康,其发病率和死亡率居各种疾病之首。溶解血栓是治疗这类疾病的首选方法。目前临床上治疗血栓和栓塞主要是通过注射尿激酶(UK)、链激酶(SK)、组织型纤溶酶原激活剂(t2PA)、乙酰化纤溶酶原链激酶激活剂(APSAC)和单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(scu－PA)。这些药物均为纤溶酶原激活剂,通过激活纤溶酶原生成纤溶酶而降解纤维蛋白。在实际应用中它们都具有一定的局限性,或是毒性比较强,易引起出血,不良反应大;或是在体内半衰期短,且不易被吸收,只能静脉给药,药效难以发挥;或是来源紧缺,成本高,价格昂贵[1,2]。
纳豆(natto)在日本是一种历史悠久的大豆发酵食品,已有1000多年的历史。早在日本江户时代,纳豆就作为一种健康食品,可用来治疗风邪、醒酒,也用来预防和治疗心脑血管疾病;现代研究认为,纳豆具有抗血栓、降血压、抗菌、抗氧化、预防癌症等多种生理调节功能。此外,它兼有减轻疲劳,治疗脚气病的功效,每天坚持服用200g纳豆就可预防脑血管意外的发生。纳豆的传统制法与中国的豆豉类似,将精选的小粒黄豆浸泡并蒸熟,然后用稻草包扎起来,维持一定的温湿度,培养1～2d,发酵过程中豆粒会被一种粘稠状的聚合物所覆盖,这种粘稠状的物质能拉成长丝。其独特的味道是由一种特殊品系的枯草杆菌——纳豆芽孢杆菌(bacillusnatto)发酵作用产生的。而其各种有效成分中最受瞩目的是具有溶血栓作用的
纳豆激酶,文献报道显示,纳豆中除了纳豆激酶外,还存在尿激酶、弹性蛋白酶以及尿激酶原激活剂等[3,4],这可能是由于菌株和生产工艺的不同造成的。
1987年,Sumi等[5]首次报道在纳豆中存在一种具有强烈纤溶活性的酶——纳豆激酶(nattokinase,NK;subtilisin, NAT) 。研究表明, NK是一种丝氨酸蛋白酶,是由纳豆菌(bacillus subtilis var.natto)产生的一种具有强烈溶栓功能的蛋白酶,是一种枯草杆菌蛋白酶(subtilisin),能显著溶解体内外血栓,明显缩短优球蛋白的溶解时间(ELT),并能刺激静脉内皮细胞产生纤溶酶原激活剂,从而更有效地发挥溶栓效果[6]。实验研究证实该酶不仅易于提取纯化,成本低廉,溶栓效果好,作用迅速,药效时间长,而且安全性好,无任何毒副作用[7],因此有望成为一种新型溶栓药物。
1 纳豆激酶的结构
1.1 纳豆激酶的核苷酸序列
Nakamura等[8]于1992年用鸟枪法首先在大肠杆菌(E.coli)宿主载体系统中克隆得到了包括调控序列在内的NK基因(又称枯草杆菌蛋白酶NAT基因,aprN)的全长序列。该基因长1 473 bp,以GTG为起始密码子,其上游- 17 bp 至- 11 bp位点为核糖体结合位点S－D序列:AAAGGAG。S2D序列上游是A/T含量高达72%的转录调控区,但在此区尚未找到与已知枯草杆菌蛋白酶启动子相类似的保守序列。起始密码子后是1143 bp组成的开放阅读框架(ORF) ,编码共381个氨基酸残基组成的多肽,其中包括: 29个氨基酸残基组成的信号肽,77个氨基酸残基组成的前肽和275个氨基酸残基组成的成熟肽——NK。结构基因的3'末端为连续的3个终止密码子TAA, TAG,TAA,终止密码子之后位于成熟蛋白区域C端下游7 bp 处有一段序列可形成茎环结构,即ρ因子非依赖性终止序列[8]。
1.2 纳豆激酶的蛋白质结构
纯化的NK做SDS2PAGE,在28 000 u处有明显条带。不同的测定方法测得的NK分子量由27 300D(≈27.3×103)到35 000 D(≈35×103)不等,但根据其基因的DNA序列推测氨基酸的1级序列,可知是由275个氨基酸残基组成的单链多肽,无二硫键,准确分子量应为27728 D (≈27.73×103) [8]。NK的序列中含有8个赖氨酸残基,没有半胱氨酸残基,内肽酶可将其水解成为9个小肽,成熟肽组成与氨基酸序列测定相符。NK作为丝氨酸蛋白酶,其活性中心为Asp32、His64和Ser221,与底物结合部位在Ser125、Leu126、Gly127处[9]。NK的信号肽包含1个带3个正电荷的亲水N端以及一段不带电的疏水残基序列。其切割位点位于Ala2Gln2Ala保守序列之后。另外,NK基因编码序列中还有1个不同于多数原核基因的特点,即在信号肽和成熟肽之间有一段231个核苷酸编码的前肽序列。通常,真核细胞在分泌蛋白酶之前,先在胞内合成无活性的酶原,分泌到胞外后,切断前肽部分成为有活性的蛋白酶。而NK则与真核细胞的蛋白酶分泌一致,这种现象在原核生物中较罕见。
NK与大多数枯草菌素在核苷酸序列和氨基酸组成上具有高度同源性。如NK与枯草菌素E (SubtilisinE)的核苷酸序列均由1473个核苷酸组成,只有13个碱基不同,其中12个在成熟肽编码序列,氨基酸组成只有2个氨基酸有差异,同源性高达99.5%;与枯草菌素amylosacchariticus(subtilisin amylosacchariticus)相比, 27个碱基不同,20个在成熟肽区域,有3个氨基酸不同,同源性达99.3%; 此外, NK与枯草菌素BPN′(subtilisin BPN')、枯草菌素carlsberg (subtilisincarls－berg)在氨基酸组成上同源性亦达86%和72%。普遍认为,枯草菌素有启动并指导枯草杆菌孢子形成的功能,推测可能在协助细胞裂解,释放孢子过程中发挥作用。尽管这些枯草菌素一级结构具有如此惊人的一致性,但它们却在一些酶动力学参数以及底物特异性上迥异,估计与空间构象不同相关[9,10]。
近年来,NK的分子生物学研究取得了很大进展,很多研究者都克隆出了NK基因并成功表达。一些学者利用PCR技术从分泌纳豆酶的枯草杆菌基因组DNA中扩增得到了NK基因,利用基因重组技术构建了NK基因的表达载体, 在大肠杆菌中实现了表达[11];刘北域等[12]则在大肠杆菌中表达NK原基因,并使NK基因在芽孢杆菌属中进行了表达。
2 纳豆激酶的理化特性
2.1 分子量和等电点
NK为白色粉末状、无臭味。现由分离纯化的NK基因DNA序列推出其氨基酸序列,根据该顺序计算出该酶的准确分子量为27 728 D(≈27.73 ×103 ) ,远小于尿激酶的分子量54 000 D (≈54×103)。用Svun-sson柱型电泳法等电聚焦测得NK具有对称的单一的纤溶酶峰,其PI值为(8.6±0.3) [8] 。
2.2 理化性质
在pH 6.0～12.0情况下,NK比较稳定, pH低于5.0时,则很不稳定。40℃保温30min,酶活无损失,温度超过50℃时,活力逐渐丧失,超过60℃时,则因蛋白变性而迅速失活。研究表明,冻融对NK活性影响不大,反复冻融5个循环,酶活性仍保持95%以上。若添加明胶,可使其热稳定性提高5倍以上[13,14]。当NK与煮沸过的小麦或大米提取液、肉汤以及血清蛋白和胃粘液蛋白混合后,NK的稳定性显著提高,甚至在酸性条件下,仍保持有酶活性[5]。说明NK在胃环境中能保持一定的活性,因此可口服来达到溶栓目的。NK的活性不受5mmol/L半胱氨酸(Cys)的影响,但1mmol/L二异丙基氟代磷酸酯(DFP)和5 mmol/L敌百虫(neguron)和5mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)则能完全抑制该酶活性,由此可推测该酶的活性中心是丝氨酸结构[5,9] 。它的活性受金属离子影响,Cu2+ 、Zn2+和Al3+等金属离子对NK有明显的抑制作用, Hg2+可使其完全失活,而Mg2+和Co2+对该酶则有显著的激活作用。此外,NK可与血浆α2巨球蛋白按摩尔比2∶1结合而失去活性。添加甘油、丙二醇、牛血清蛋白和海藻酸钠等有利于提高酶的热稳定性[15]。
2.3 底物特异性
Sumi等[5]通过对几种人工合成的小分子短肽作为反应底物,研究该酶的酰胺水解活性,发现NK最敏感的底物是血浆纤维蛋白溶酶(plasmin,纤溶酶)S－2251 (H－D－Val－Leu－Lys－pNA) ,对凝血酶(thrombin)底物S－2238(H－D－Phe－Pip－Arg－pNA)和激肽释放酶( kal－likrein)底物S－2302(H－D－Pro－Phe－Arg－pNA)也有一定活性,而对尿激酶底物S－2444 (Pyro－Glu－Gly－Arg－pNA)和弹性蛋白酶(elastase) 底物S－2484 (Pyro－Glu－Pro－Val－pNA)则无明显活性。这说明NK有其特异的蛋白水解作用和识别位点。另有报道[9] ,NK对枯草杆菌蛋白酶和糜蛋白酶(chymotrypsin)的底物Suc－Ala－Ala－Pro－Phe－pNA也有高度水解活性。以氧化型胰岛素B链为作用底物,研究NK的酶切特性,发现NK有严格的识别位点及限制性酶切位点,首选酶切位点在Leu15－Tyr16,其次在Ser9－His10,在Gln4－His5及His5－Leu6也有微弱的水解活性。与其它一些枯草杆菌蛋白酶不同的是,NK对氧化型胰岛素B 链C端Tyr16－Ala30之间的肽段却无任何酶切特性[9]。
3 纳豆激酶的实验和临床研究
NK是目前发现的近200种具有口服溶纤作用的物质中最具潜力的溶纤蛋白酶,用纤维蛋白板测定NK活性,结果显示,1g纳豆中提取的NK活性相当于40 CU纤溶酶或1 600U尿激酶单位,具有很高的经济价值。通过动物血栓模型研究NK的溶栓活性,发现NK不仅有很强的溶栓作用,同时还可抑制血栓的形成,并在一定范围内呈量效关系。体外研究显示NK能够剂量依赖性地降低红细胞聚积性和血液低切粘度[16]。另据报道,NK中含有血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)的成分,这种抑制剂具有抗高血压和心力衰竭作用,因此可以进一步研究NK在治疗高血压和心力衰竭方面的应用。
3.1 纳豆激酶的体外溶栓实验
NK的体外溶栓作用十分明显,最早就是因为其具有显著体外溶栓效果而被发现的。NK可水解纤维蛋白成小肽和氨基酸,当酶提取液滴加到纤维蛋白平板上,即出现透明的溶解圈,酶活性越大,溶解圈越大[2,5]。王萍等[17]发现NK粗酶体外溶栓作用显著,高剂量(2 836 U)和低剂量(1 418 U)作用凝血块6h后,溶解率分别为88%和74% ,蚓激酶(150 000 U)为87%。
3.2 纳豆激酶的体内溶栓实验
3.2.1 用纤维蛋白平板法和溶解时间标准曲线法测定,在以大鼠为对象的动物实验中经过静脉注射发现NK的纤溶能力是血纤维蛋白溶酶的4倍以上[18]。在小鼠十二指肠内给药,3～5 h即可检测出NK并产生纤溶效果;对兔血栓模型也有明显的溶栓作用。
3.2.2 以大鼠为实验动物,研究发现NK可由消化道吸收到血液中而起纤溶作用,而且NK在发挥纤溶作用时,不是激活纤溶酶原,而是直接作用于交联纤维蛋白[7]。NK对交联纤维蛋白水解活性很强,但对纤维蛋白原却不敏感,提示NK在发挥纤溶作用时,不水解血浆纤维蛋白原,不易引起出血倾向[7]。
3.2.2 以大鼠为实验动物,研究发现NK可由消化道吸收到血液中而起纤溶作用,而且NK在发挥纤溶作用时,不是激活纤溶酶原,而是直接作用于交联纤维蛋白[7]。NK对交联纤维蛋白水解活性很强,但对纤维蛋白原却不敏感,提示NK在发挥纤溶作用时,不水解血浆纤维蛋白原,不易引起出血倾向[7]。
3.2.3 从狗的股大静脉注入血清纤维蛋白原和牛凝血酶,使其形成体内静脉血栓,实验组的狗服用4 粒NK胶囊(250 mg/粒),对照组则服用煮熟大豆,测定狗血浆的纤溶活性,并通过血管造影术观察血栓溶解情况,实验表明,对照组狗在服用熟大豆18h后,仍无溶栓现象,而实验组狗5h后血栓即完全溶解,血液循环完全恢复[5]。
3.2.4 在小鼠颈总动脉中注射醋酸造成内皮细胞损伤生成血栓,分别静脉注射等摩尔数的NK、纤溶酶和弹性蛋白酶,测定血流再通率和纤维蛋白残留率,观察体内溶栓活性。1h后血流的再通率分别是(62.0±5.3)%, (15.8±4.5) %和0%[18]。说明NK的体内溶栓效果远远大于纤溶酶和弹性蛋白酶。
3.2.5 NK可剂量依赖性的对抗小鼠体内血栓形成。实验显示对照组小鼠静注血栓诱导剂后, 15min内血流恢复率为0,阿司匹林阳性对照组和NK高剂量组血流恢复率为100%,而NK中、低剂量组的恢复率分别为60%和20%。NK15 000、7 500、3 750 U/kg均能显著延长小鼠凝血时间(CT) (P<0.01) 。NK2 500 U /kg和5 000 U/kg能显著延长兔血液凝血酶原时间(PT) 、活化部分凝血活酶时间(APTT),显著降低兔血液纤维蛋白原(FIB)含量; 5 000 U /kg还能显著延长凝血酶时间(TT) [19]。
3.2.6 王俊菊等[20]的研究结果发现固体粉末NK的活性为565 510U/g,是尿激酶的3.13倍;液体NK的活性为15 234 U/ml;NK能显著延长家兔全血凝固时间、血浆复钙时间、凝血酶时间、大鼠凝血活酶时间、凝血酶引起的纤维蛋白凝固时间、大鼠凝血酶原时间。NK对凝血过程的3阶段都有影响。
3.3 纳豆激酶的调脂作用
研究表明纳豆粗提物可降低血脂水平,通过升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL2C)、降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL2C)调节脂质代谢,具有抗脂质过氧化作用,在预防动脉粥样硬化形成过程中发挥作用。段智变等[21]用高脂饲料建立实验性高血脂症兔模型,模型建立第8周时,纳豆粗提物组血清总胆固醇、三酰甘油、LDL2C、丙二醛、动脉粥样硬化指数(AI)分别比模型组降低了39.88%(P<0.05) 、44. 54% (P<0.05) 、48. 84%(P<0.05) 、48. 25% (P<0.01)、70.20%,而HDL2C、超氧化物歧化酶( superoxide dismutase, SOD)含量分别提高了75.81%(P<0.01) 、38.32% (P<0.01)。袁淑云[22]的研究也取得了类似的结果。
3.4 纳豆激酶的抗动脉粥样硬化作用
Suzuki等[23]在大鼠血管内皮损伤前3 周开始给予纳豆提取物(含NK) ,血管内皮损伤后继续给予3周,3周后纳豆提取物组的内膜/中层厚度比值较对照组明显减少[ (0.06±0.01 ) vs (0.15±0.03) , P<0.05];优球蛋白凝块溶解时间缩短。表明纳豆提取物具有血栓溶解活性,通过抑制血管壁血栓形成而减少内膜增厚。
3.5 纳豆激酶的保护心肌缺血作用
李欣志等[24, 25]给Beagle犬重组NK(r－NK) 1周后发现血小板计数下降, PT明显延长,Fib含量明显降低,纤溶酶原(PLG)活性升高。r－NK 0.25～0.5mg·kg-1能促使猪冠脉血栓溶解,显著缩小血栓面积,促进血管的再通;同时可明显减轻心肌缺血程度(Σ－ST),缩小心肌梗死面积,降低心肌梗死动物血清中心肌型肌酸激酶同工酶(CK2MB)活性。
3.6 纳豆激酶的临床应用
实验表明健康人服用NK可明显缩短优球蛋白的溶解时间(ELT),促进纤溶活性,作用时间可维持2～8h,大大长于目前临床上使用的溶栓药物。健康人口服NK后1～8d,血浆优球蛋白纤溶活性(EFA)逐渐升高,在第8d达到峰值,同时伴随血浆纤维蛋白降解产物(FDP)增高,表明纤维蛋白迅速降解。另外发现t－PA的量不断增加,第4d达到最高,是未服用NK时的1.4倍,血浆t－PA水平增高可维持8d[6]。NK本身无t－PA抗原性,NK是否通过诱导血管内皮细胞合成t－PA从而发挥溶栓作用,有待进一步研究。
以往认为NK是枯草杆菌中唯一具有纤溶活性的蛋白酶。但齐海萍等[26]从12个不同产地的豆豉中筛选出产纤溶酶活性为1 230～1256 U /mL的菌株,经鉴定初步推断属芽孢杆菌属。Kim等[27]发现,韩国发酵食品Chungkook－Jang的工程菌Bacillus sp.strainCK能分泌一种具有强纤溶活性的蛋白酶CK,其N端的14个氨基酸组成与NK不同。是否还有其它枯草杆菌也能分泌高纤溶活性的蛋白酶尚待研究。
