基于网络药理学附子泻心汤治疗慢性萎缩性胃炎作用机制研究

摘  要：目的  探究附子泻心汤治疗慢性萎缩性胃炎的作用机制。方法 利用TCMSP数据库筛选附子泻心汤4味中药的活性成分及相应靶点；利用DisGeNet数据库筛选慢性萎缩性胃炎相关靶点，运用Cytoscape软件构建疾病–药物–靶点网络；通过STRING数据库进行蛋白互作网络（PPI）分析，得到核心靶点。利用R语言“clusterprofiler”包进行基因功能GO分析和KEGG通路富集分析。结果  共得到附子泻心汤87个活性成分，216个作用靶点，得到慢性萎缩性胃炎相关靶点639个，药物与疾病交集靶点85个，其中核心靶点包括AKT1、TP53、VEGF、TNF、PTGS2、IL6、JUN、CASP3等。附子泻心汤主要参与脂多糖应答、对细菌起源的分子应答、活性氧化物代谢、氧化应激、金属离子应答、信号通路调节等生物过程，通过调节PI3K-Akt信号通路、AGE-RAGE信号通路、乙型肝炎等通路发挥治疗慢性萎缩性胃炎的作用。结论  附子泻心汤可通过多靶点、多机制、多途径治疗慢性萎缩性胃炎。

慢性萎缩性胃炎是临床常见的消化系统疾病之一，以胃黏膜上皮和腺体萎缩为特征，具有无特异性症状、复发率高、不易治愈的特点^[1]。多项研究发现，胃黏膜的异型增生存在不同比例、不同程度的癌变率，严重影响患者健康^[2-3]。中医并无慢性萎缩性胃炎病名的明确记载，依据其临床症状，可将其归入“胃痞”“胃脘痛”“嘈杂”等的范畴^[4]。附子泻心汤组方为大黄、黄连、黄芩、附子，首见于《伤寒论》，该书第155条“心下痞，而复恶寒汗出者,附子泻心汤主之”。其中大黄有泻热和胃、破血祛瘀之功；黄连清热祛湿，尤其善清泻心胃之火；黄芩清热燥湿，能泻中焦实火；附子炮制发挥其温阳散寒之长，诸药合用，可有寒热并治，温经扶阳，泻热消痞之效。近年来，附子泻心汤在临床上已被广泛运用于内分泌、循环、泌尿等诸多系统的疾病的治疗，在多种消化系统疾病如慢性胃炎、上消化道出血、溃疡性结肠炎、便秘的治疗上更发挥了重要的作用^[5-7]。近年来已有药理研究发现附子能通过扩张血管、增加血流灌注量来显著改善胃黏膜萎缩的程度^[8]。大黄和黄连则在清除幽门螺杆菌、抑制胃酸分泌、保护胃黏膜、抗炎等方面具有非常优秀的药理活性^[9]。黄芩亦能较好的抑制炎症反应、阻止肿瘤细胞增殖、防止胃黏膜损伤^[10]。故附子泻心汤全方4药合用，对胃黏膜炎症、萎缩具有良好的缓解与治疗作用，即附子泻心汤治疗慢性萎缩性胃炎具有药理学方面的理论依据的支持，而临床上在运用附子泻心汤治疗慢性萎缩性胃炎方面也取得了一定的进展^[7,11-14]。本研究旨在通过网络药理学研究方法，探索附子泻心汤治疗慢性萎缩性胃炎的作用机制，为其在临床上的应用提供依据。

1  方法

1.1  化学成分及作用靶点构建

通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmsp.php），以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18作为筛选条件，分别检索附子、大黄、黄连、黄芩的化学成分及其对应靶点，借助Uniprot数据库（http:// www.uniprot.org/）将所得靶点转换成对应基因名。

1.2  慢性萎缩性胃炎相关靶点获取

利用DisGeNet数据库（https://www.disgenet. org），以“chronic atrophic gastritis”为关键词进行检索，以关联度≥0.9为筛选条件，从数据库中得到符合条件的慢性萎缩性胃炎相关靶点。

1.3  “疾病–靶点–复方网络”的构建和分析

利用在线韦恩图网站（https://bioinfogp.cnb. csic.es/tools/venny/）绘制附子泻心汤与慢性萎缩性胃炎相关靶点韦恩图，得到交集靶点。采用Cytoscape软件（Version3.7.1）构建疾病–靶点–复方网络。

1.4  蛋白互作（PPI）网络的构建

将药物–疾病共同靶点上传至STRING数据库平台（https://STRING-db.org/）进行PPI网络分析，得到附子泻心汤与慢性萎缩性胃炎的PPI网络及核心基因。

1.5  关键靶点基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路分析

利用R语言“clusterprofiler”包对获得的共同靶点进行GO分析及KEGG通路富集分析，将所得结果根据显著性大小排列，选择前20个结果以气泡图展示。

2  结果

2.1  附子泻心汤活性成分的筛选

通过TCMSP数据库筛选，共得到附子泻心汤87个活性成分，其中大黄16个，附子21个，黄连14个，黄芩36个，见表1。

2.2  附子泻心汤成分治疗慢性萎缩性胃炎的潜在作用靶点预测

根据上述活性成分，通过TCMSP平台获得大黄作用靶点110个，黄连作用靶点308个，黄芩作用靶点507个，附子作用靶点30个，去重后，得到附子泻心汤作用靶点216个。在DisGeNet数据库中，以“chronic atrophic gastritis”为关键词进行检索，以关联度≥0.9为筛选条件，得到符合条件的疾病靶点共639个。通过在线韦恩图平台（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）将药物靶点与疾病靶点取交集（图1），得到共同靶点85个。

2.3  疾病–靶点–复方网络的构建与分析

通过Cytoscape 3.7.1软件绘制疾病–靶点–复方网络（图2），得到了一个包含135个点和464条连线的网络。以度值（degree）作为拓扑分析的主要参考依据，排名前5位的活性成分是黄芩黄酮（rivularin）、5,7,4'-三羟基-8-甲氧基黄酮（5,7,4'-trihydroxy-8-methoxyflavanone）、5,7,4'-三羟基-6-甲氧基黄酮（5,7,4'-trihydroxy-6-methoxyflavanone）、苏荠苎黄酮（moslosooflavone）、邻苯二甲酸二异辛酯（diop），见表2。这些度值较高的化学成分可能是附子泻心汤发挥治疗慢性萎缩性胃炎的关键化合物。这体现了中药方剂多成分、多靶点的作用机制。

2.4  PPI网络的构建及分析

将附子泻心汤与慢性萎缩性胃炎的共同靶点上传至STRING数据库，并利用Cytoscape3.7.1软件进行PPI网络可视化（图3）。该PPI网络有85个节点，1 614条边，平均节点度值为37.98。

根据度值降序排列绘制簇状图，得到前20个PPI网络的核心基因（图4）。

2.5  GO富集分析

GO分析结果显示，附子泻心汤与慢性萎缩性胃炎的85个交集靶点基因影响2 066个生物学过程。排名靠前的生物学功能有脂多糖应答（31个靶点：NOS2/PTGS2/JUN/CASP9/CASP3/CASP8/TGFβ1/TNF/IL1B/AKT1/FOS/MAPK1/IL-10/IL-6/NFK-BIA/CYP1A2/GJA1/CYP1A1/ICAM1/CCL2/SELE/VCAM1/CXCL8/THBD/SERPINE1/MPO/GSTP1/C-XCL2/CHUK/FASLG/MAPK14）；对细菌起源的分1/GSTP1/CXCL2/CHUK/FASLG/MAPK14）；活性氧化物代谢（27个靶点：NOS2/PT53/IL-1B/MMP3/ EGFR/AKT1/IL-10/XDH/SOD1/HIF1A/CYP1A2/ CRP/MAPK14）；氧化应激（27个靶点： MMP3/EGFR/AKT1/FOS/MMP2/MMP9/MAPK1/IL-10/IL-6/SOD1/HIF1A/STAT1/DUOX2/HSP-B1/MPO/GSTP1/NFE2L2/CHUK/MCL1）；金属离子应答（24个靶点：PTGS2/JUN/BCL2/CASP9/CASP3/CASP8/PCNA/CCND1/FOS/MMP9/MAPK1/SOD1/HIF1A/CYP1A2/CYP1A1/ICAM1/VCAM1/PTEN/IL-1A/NFE2L2/CHUK）；信号通路调节（24个靶点：AR/PTGS2/BCL2/BAX/CASP8/TNF/TP53/IL1B/AKT1/BCL2L1/MMP9/RB1/SOD1/HIF1A/ICAM1/HSPB1/SERPINE1/PTEN/IL1A/GSTP1/NFE2L2/FASLG/GAK3B/MCL1）等，见图5。

2.6  KEGG通路富集分析

对附子泻心汤与慢性萎缩性胃炎的85个交集靶点基因进行KEGG通路富集分析（图6）。关键靶点主要富集于慢性萎缩性胃炎中的PI3K-Akt信号通路、AGE-RAGE信号通路、乙型肝炎等，提示附子泻心汤通过作用多条通路来发挥治疗慢性萎缩性胃炎的作用。

3  讨论

本研究结果显示，通过TCMSP数据库筛选共得到附子泻心汤活性成分87个，其对应的作用靶点有216个，经DisGeNet数据库筛选后共得到慢性萎缩性胃炎相关靶点639个。通过绘制附子泻心汤与慢性萎缩性胃炎相关靶点韦恩图，得到药物–疾病交集靶点85个。

通过对疾病-靶点-复方网络的的分析发现黄芩黄酮、5,7,4'-三羟基-8-甲氧基黄酮、5,7,4'-三羟基-6-甲氧基黄酮、苏荠苎黄酮、邻苯二甲酸二异辛酯的度值较高，是附子泻心汤发挥治疗慢性萎缩性胃炎8-甲氧基黄酮及5,7,4'-三羟基-6-甲氧基黄酮为黄酮类成分，具有抗炎、抗氧化、免疫调节等作用^[16]；苏荠苎黄酮已被证实能通过与特定靶标进行结合，调控人腺苷A1受体（ADORA1）、ADORA2A、前列腺素内源性过氧化物合酶（PTGS2）、组织蛋白酶G（CTSG）、一氧化氮合酶（NOS）2和NOS3的方式来抑制炎症的发生与发展^[17]；diop可通过与筛选的靶标结合，调控核受体亚家族3C组成员1（NR3C1）进而抑制特应性皮炎的炎症反应，起到预防和治疗特应性皮炎的作用^[18]。

STRING数据库蛋白互作网络分析结果提示附子泻心汤与慢性萎缩性胃炎核心基因涉及蛋白激酶Bα（AKT1）、TP53、血管内皮生长因子（VEGF）、肿瘤坏死因子（TNF）、PTGS2、IL-6、JUN、胱天蛋白酶3（CASP3）等。AKT1作为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶之一^[19]，其度值高于其他靶点，具有通过介导NF-κB炎症信号通路的活化而加速慢性萎缩性胃炎的发生及进展的作用^[20-22]。肿瘤抑制因子TP53能通过细胞周期调控起到炎症抑制作用^[23]，还能通过促进细胞凋亡而阻止癌细胞及机体肿瘤的发生。VEGFA是PDGF/VEGF生长因子家族的成员，郝婷婷等^[24]的研究表明幽门螺杆菌可刺激人胃上皮细胞VEGF过度表达，促进血管生成，从而参与了由慢性萎缩性胃炎到胃癌的整个的演变过程；TNF也是一种促炎因子，现已有研究表明其水平的升高与胃黏膜萎缩的进展密切相关^[25]。PTGS2能够激活分布在血小板和内皮细胞上的前列环素受体G蛋白，从而松弛血管平滑肌及抑制血小板聚集^[26]；炎症因子IL-6是参与炎症反应的主要成分代表，可反映机体炎症反应程度^[27]；CASP3则被证实可通过特异性裂解底物而广泛参与到细胞凋亡的过程中^[28]。以上结果提示，附子泻心汤主要通过调控炎症反应、细胞凋亡、肿瘤血管生成等过程的基因来发挥治疗慢性萎缩性胃炎的作用。

进一步进行GO功能富集分析，结果显示附子泻心汤治疗慢性萎缩性胃炎涉及的多个生物学过程，主要集中于脂多糖应答、对细菌起源的分子应答、活性氧化物代谢、氧化应激、金属离子应答、信号通路调节等，提示附子泻心汤治疗慢性萎缩性胃炎可以通过作用于多个靶点来发挥作用。KEGG富集通路分析发现关键靶点主要富集于慢性萎缩性胃炎中的磷脂酰肌醇-3-羟激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路、晚期搪基化终产物及其受体（AGE-RAGE）信号通路、乙型肝炎等。慢性萎缩性胃炎属于癌前病变，抑制由慢性萎缩性胃炎到胃癌的整个演变有着重要的临床意义。PI3K-Akt信号通路通过参与细胞的生长、增殖、凋亡等过程可以调控多种癌症发生与进展^[29]。研究表明^[30-32]，中药可以通过提高抑癌基因PTEN的表达及降低胞内磷脂酰肌醇激酶PI3K的表达从而抑制PIP2磷酸化为PIP3的整个过程，最终起到阻止PI3K-Akt信号通路被激活，抑制慢性萎缩性胃炎向胃癌的发展的作用。近年来，已有相关研究表明AGE-RAGE信号的研究发现随着乙肝病毒在人体内复制的时间的增加，胃黏膜萎缩比例及严重程度也逐渐升高，提示乙肝病毒信号通路与慢性萎缩性胃炎的发生和发展密切相关。当乙肝病毒在人体内复制时会激活髓样分化因子88（MyD88），促进白细胞介素-1受体相关激酶4（IRAK4）的磷酸化，进而激活TGF-β激活激酶1（TAK-1），使IKB激酶（IKK）活化为IKB，进而促进TNF-α、IL-6等炎性细胞因子的释放^[36]，最终加重胃黏膜的炎症与萎缩。

综上所述，本研究利用网络药理学证明了附子泻心汤可通过多成分、多靶点、多通路协同作用治疗慢性萎缩性胃炎。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略） 

来  源：王  晨，王  建，刘万里． 基于网络药理学附子泻心汤治疗慢性萎缩性胃炎作用机制研究 [J]. 现代药物与临床, 2021, 36(10): 2008-2016 .