葡萄Vitis vinifera L. 是葡萄科（Vitaceae）落叶木质藤本植物葡萄的果实，是世界上起源最古老的果树树种之一。千百年来，葡萄因其具有较高的药用价值和营养价值而受到人们的青睐，被认为是一种具有“治愈能力”的水果[1]。《本草纲目》记载“葡萄主治筋骨湿痹，益气倍力强志，令人肥健。耐饥忍风寒。久食，轻身不老延年。可作酒。逐水，利小便，除肠间气，调中治淋。时气痘疮不出，食之，或研酒饮，甚效[2]。”现代研究发现葡萄具有抗氧化、调血脂、修复肝损伤、增强机体免疫等功能[3-5]。
葡萄中所含成分既包括脂质、糖类等初生代谢产物，还包含一些次生代谢产物，如多酚等[6]。葡萄多酚（grape polyphenols，GP）易被氧化成醌式结构而具有较强的抗氧化、抗炎能力，为葡萄中含量最为丰富的活性成分，主要存在于葡萄皮与籽 中[7-8]。现代研究证实GP具有明显的抗肿瘤作用，其作用途径主要包括诱导肿瘤细胞凋亡、使细胞周期阻滞、降低基质金属蛋白酶（matrix metallo- proteinases，MMP）活性进而抑制肿瘤转移以及增强机体免疫功能等[9-14]。除了小分子成分，葡萄中还含有大量的生物大分子物质。研究发现，葡萄果肉中存在大量的由脂质等构成的囊泡结构（grape- derived vesicles，GDVs），这些结构可能是细胞内外物质和信息交换的主要媒介[6,15]。限于多酚和囊泡在葡萄中分布的异域性，本课题组设想将GP和GDVs分别提取后进行重组，能更高效地实现有效物质的汇聚与运输。另外，多酚具有很强的蛋白/多肽沉淀作用[16]，有利于二者结构的稳定和功能的固化。
本课题组前期通过制备茶多酚和蜂毒肽（melittin，Mel）复合物，成功构建了纳米药物共传递系统，表现出显著的抗肿瘤特性[17]。受此鼓舞，本实验仍以Mel作为模型药物，利用其与GP的聚集性质和囊泡的负载能力，构建载多肽的葡萄重组囊泡（GPMC-GDVs），筛选优化制备过程涉及的多项工艺条件和载药技术，创新动物多肽类药物的递送方式，为解决毒肽药物的毒副作用和成药性难题提供可借鉴的制剂学参考。
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2.1 GP含量测定
2.1.1 对照品溶液配制 取没食子酸对照品5 mg，精密称定，置于50 mL量瓶中，去离子水定容至刻度，摇匀，得到质量浓度为0.1 mg/mL的没食子酸对照品溶液，−4 ℃保存备用。
2.1.2 供试品溶液配制 精密称取GP粗提物2 mg，置于100 mL量瓶中，去离子水定容至刻度，超声溶解，放冷，滤过即得，−4 ℃保存备用。
2.1.3 显色方法 采用福林-酚（Folin-phenol）法[18]进行显色，取待测液1 mL于10 mL量瓶中，依次加入3 mL去离子水，1.5 mL福林-酚试剂，混匀，5 min内加入3 mL 20%碳酸钠溶液，去离子水定容至10 mL，室温于暗处静置2 h。1 mL去离子水替代供试品溶液按上述方法配制空白溶液。
2.1.4 测定波长的选择 取稀释10倍后的没食子酸对照品溶液1mL于10 mL量瓶中，按照“2.1.3”项下方法显色，以空白试剂作为参比，紫外-可见分光光度计进行200～800 nm全波长扫描，测得最大吸收波长为760 nm。
2.1.5 线性范围考察 分别吸取没食子酸对照品溶液0.25、0.5、0.75、1.25、2.0 mL于25 mL棕色量瓶中，去离子水定容至刻度。按照“2.1.3”项下方法显色，于760 nm处测定吸光度（A）值，每个样品平行测3次，以没食子酸质量浓度为横坐标（X），A值为纵坐标（Y）绘制标准曲线。结果显示没食子酸在0.001～0.008 mg/mL与A值呈现良好的线性关系，回归方程为Y＝111.83 X＋0.011 5，r2＝0.999 5。
2.1.6 精密度试验 精密称取适量GP粗提物，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按照“2.1.3”项下方法显色，于760 nm处连续测定6次，记录A值，计算RSD值为0.98%，表明该条件下仪器精密度良好。
2.1.7 稳定性试验 精密称取适量GP粗提物，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.3”项下方法显色，分别在不同时间点0、1、2、4、6 h测定A值，计算RSD值为1.95%，表明供试品溶液在6 h内稳定。
2.1.8 重复性试验 精密称取GP粗提物6份，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.3”项下方法显色，于760 nm处测定A值，计算GP含量的RSD为1.87%，表明该方法重复性良好。
2.1.9 加样回收率试验 精密称取6份已测定的GP粗提物，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别加入适量0.1 mg/mL没食子酸对照品溶液，再按照“2.1.3”项下方法显色，测定A值，计算加样回收率。结果显示，测得的平均回收率为98.91%，RSD为2.57%，表明方法回收率良好。
2.2 GP提取工艺研究
2.2.1 葡萄处理 手动剥取葡萄皮与籽，冷冻干燥，粉碎备用。
2.2.2 单因素实验考察 准确称取葡萄皮与籽粉末（质量比为5∶1）5.00 g，采用乙醇溶液提取多酚，分别对乙醇体积分数、料液比、提取温度、提取时间、提取次数进行单因素考察。多酚提取率用760 nm处A值表示，其A值检测按照“2.1.3”项下方法测定。结果显示GP提取工艺为乙醇体积分数60%，料液比1∶10，提取温度45 ℃，提取2次，每次提取60 min。
2.2.3 正交试验考察 为了综合考察多种因素对GP提取效率的影响，在单因素考察结果的基础上，选择4因素3水平的正交试验分析优化GP提取工艺。以多酚质量分数为指标，提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）、提取次数（D）为考察因素，采用L9(34)正交表进行试验，因素水平表与正交结果见表1，方差分析结果见表2。
根据正交试验结果可知，A3B1C2D2组合对GP的提取效率最高，即以60%乙醇溶剂，以1∶10的料液比，在50 ℃条件下，提取50 min，提取2次。方差分析可知，4种因素对GP提取效率的影响程度依次为A＞C＞B＞D，即提取温度对GP提取效率的影响最大，其次是料液比，提取时间和提取次数影响最小。
2.2.4 验证试验 称取葡萄皮与籽粉末3份，按正交法确立的提取工艺进行验证，得到GP粗提物，测定粗提取物中多酚的含量。结果显示多酚平均含量为25.15%，RSD为2.28%。该工艺条件稳定，能够用于GP的提取。
2.3 GP纯化工艺研究
2.3.1 树脂筛选 利用大孔树脂对化学成分的吸附可逆性能选择最佳的树脂型号[19]。称取4种树脂各5.0 g于具塞三角瓶中，加入100 mL质量浓度为4 mg/mL GP粗提液，室温下吸附12 h，滤过，滤液于760 nm处测定A值。树脂加入到体积为100mL，体积分数为80%乙醇溶液中，于室温下解吸12 h，滤过，检测解析液A值。结果AB-8的吸附率为80.82%，解吸率为74.45%；D101的吸附率为79.03%，解吸率为75.21%；NKA-9的吸附率为67.05%，解吸率为61.08%；XAD-7Hp的吸附率为89.50%，解吸率为81.31%。对多酚吸附解析性能都高的树脂为最佳选择，不仅有较高的吸附量，而且能够最大程度上回收多酚类成分。XAD-7Hp型树脂不论是吸附率还是解吸率均最高，因此选取XAD- 7Hp型树脂用于后续多酚纯化的工艺参数研究。
2.3.2 上样量 称取XAD-7Hp树脂20.0 g，湿法装柱，以多酚质量浓度为4 mg/mL的GP粗提液上样，体积流量控制在1BV/h，每1 BV收集1份流出液，测每份流出液中含有的GP含量，制备泄漏曲线。由图1可知，在上样7 BV后，测得的流出液中多酚的质量浓度趋向于稳定，由此可知树脂对多酚的吸附能力接近饱和，若继续上样，多酚的吸附量基本不再增加。因此上样量定为7 BV。
2.3.3 水洗量 称取XAD-7Hp树脂20.0 g，湿法装柱，以多酚质量浓度为4 mg/mL体积为70 mL的GP粗提液上样，体积流量为1 BV/h，收集流出液。去离子水淋洗，体积流量为1 BV/h，每1 BV作为1份流出液，测每份流出液中含有的GP含量，制备水洗曲线。由图1可知，水洗量5 BV后，测得的流出液中多酚的质量浓度趋向于稳定，说明未完全吸附的样品此时已被基本淋洗下来，因此将水洗量定为5 BV。
2.3.4 乙醇体积分数 称取XAD-7Hp树脂20.0 g，湿法装柱，以多酚质量浓度为4mg/mL体积为70 mL的GP粗提液上样，体积流量为1 BV/h，收集流出液。50 mL去离子水淋洗，收集水洗液。分别用50 mL体积分数为20%、30%、50%、60%、70%、80%的乙醇洗脱，体积流量为1BV/h，收集醇洗脱液，测每份流出液中GP的含量。由表3可知，60%～70%乙醇洗脱效果最好，回收率最高。考虑成本因素，选择60%乙醇作为洗脱液。
2.3.5 乙醇用量 称取XAD-7Hp树脂20.0 g，湿法装柱，以多酚质量浓度为4 mg/mL体积为70 mL的GP粗提液进行上样，体积流量为1 BV/h，收集流出液。50 mL去离子水淋洗，收集水洗液。采用60%的乙醇作为洗脱液进行洗脱，体积流量为1 BV/h，测定流出液中葡萄总酚含量，绘制洗脱曲线。由图1可知，乙醇用量达到5 BV后，吸附的多酚已经基本被洗脱。考虑经济性和时效性，将洗脱乙醇用量定为5 BV。
2.3.6 验证试验 称取3份XAD-7Hp树脂20.0 g，湿法装柱，以多酚质量浓度为4 mg/mL的70 mL GP粗提液上样，体积流量为1 BV/h，收集流出液。50 mL去离子水淋洗，收集水洗液。用体积分数为60%乙醇洗脱5 BV，体积流量为1 BV/h，收集洗脱液浓缩，减压干燥，得到干浸膏，研磨得到GP提取物粉末。各称取3份葡萄提取物粉末，福林-酚法测定A值。结果显示，3份样品中多酚质量分数均值为54.03%，相较于GP粗提液，多酚含量提升了1倍，所得GP的纯化工艺较为稳定。
2.4 GDVs提取工艺
取“2.2.1”项下葡萄去籽和皮之后的果肉投入榨汁机榨取果汁。取出葡萄果汁，倒入等体积的PBS（pH 7.4），混匀。将葡萄果汁与PBS混合液，4 000×g离心1 h，取上层清液，继续10 000×g离心1 h。上清倒入超速离心管，以150 000×g超速离心2 h。取下层沉淀加入40 mL PBS混悬超声分散均匀，将混悬液转移至蔗糖密度梯度（8%、30%、45%、60%）溶液中，150 000×g超速离心2 h，收集8%/30%和30%/45%界面间的沉降带，加入PBS超滤离心洗去蔗糖，即为GDVs，冻干，−20 ℃保存备用。所得GDVs粒径为（155.09±3.03）nm，电位为（−24.51±1.43）mV，多分散系数（PDI）为0.211±0.040。
2.5 GPMC-GDVs制备工艺研究
2.5.1 GP与Mel（GPMC）复合工艺研究 采用正交设计优选GPMC的复合工艺。称取GP提取物与Mel分别溶于pH值为4.5、6.5、7.4的PBS缓冲溶液中，将不同质量浓度的GP溶液（0.5、1.0、2.0 mg/mL）1 mL缓慢滴入到等体积1.0 mg/mL的Mel溶液中，于25、37、50 ℃的温度下孵育0.5 h，测定粒径。因素水平表与正交结果见表4（A、B、C分别代表GP与Mel质量比、pH值、孵育温度），方差分析结果见表5。
由表4可知，3个因素对复合工艺的影响程度依次为GP与Mel的复合比例＞孵育温度＞pH值。当保持Mel质量浓度不变时，随着GP量增加，GPMC粒径呈先不变后增加的趋势，可能是过量GP使复合物聚集。温度在低于37 ℃条件下，复合物粒径变化不明显，而温度升至50 ℃时，粒径增大。此外，粒径在3种pH值条件下没有明显变化。综合分析，将GPMC的制备工艺定为室温下，将GP溶液缓慢滴加到等体积相同质量浓度的Mel溶液中，孵育0.5 h。
2.5.2 GPMC-GDVs的制备工艺研究 室温条件下，取适量质量浓度（0、2、4、10、20 mg/mL）的GP溶液5 mL在不断搅拌下缓慢滴入等体积相同质量浓度的Mel溶液中，孵育0.5 h。将5 mL质量浓度为0.4 mg/mL的GDVs溶液缓慢滴入上述一系列含不同质量浓度GP的GPMC溶液中，室温搅拌0.5 h，以粒径为指标考察GDVs与GPMC的最佳 比例。
结果由表6可知，随着GPMC（以Mel质量计）与GDVs比例的增加，GPMC-GDVs粒径逐渐增大，电位逐渐升高，显示复合比例的变化对粒子的电荷及粒子间作用力有较大影响，当比例大于5∶1时，粒径均大于200 nm。目前临床上已批准的纳米粒粒径在100～200 nm[20]，粒径过大会增加肝脾对粒子的摄取，不利于其在肿瘤部位的富集和渗透[21]，影响治疗效果。因此，确定的GPMC-GDVs制备条件为室温下，将0.4 mg/mL GDVs缓慢滴入等体积含Mel2 mg/mL的GPMC溶液中，孵育0.5 h。GPMC- GDVs粒径为（192.42±2.36）nm，多分散系数（PDI）为0.207±0.030，表面Zeta电荷为（−16.83± 2.24）mV。
2.6 GPMC-GDVs稳定性研究
取1 mL GPMC-GDVs与1 mL PBS、DMEM、10%血清混合，37 ℃孵育0、2、4、8、12、24、48 h，粒径仪测定粒径。结果见图2，在48 h内，GPMC-GDVs在3种体系中粒径均无明显变化，说明其在血液及在细胞培养环境下均能保持结构稳定，不会产生聚集沉淀。
2.7 抗细胞增殖研究
取对数生长期的SMMC-7721或HepG 2细胞以1×104/孔密度接种于96孔细胞培养板，于细胞培养箱中培养12 h，移去1640细胞培养基，加入不同质量浓度Mel、GP、GPMC、GPMC-GDVs及空白GDVs的不完全培养基200 μL（GPMC中GP与Mel质量比为1∶1，GPMC-GDVs中GDVs与Mel的质量比为1∶5），细胞随后置于培养箱中孵育24 h，吸去含药培养基，加入200μL PBS清洗1次，加入200 μL含有MTT的1640不完全培养基，37 ℃孵育4 h，小心吸弃培养基，加入150 μL的DMSO，摇匀，于570 nm处测定A值。
利用协同系数（CI）[22]评价GP与Mel的协同程度，CI＝D1/Dm1＋D2/Dm2，式中D1和D2分别是联合给药达到影响分数（fraction affected，Fa）抑制率时GP和Mel的质量浓度，Dm1和Dm2分别是单独给药达到Fa抑制率时GP和Mel的质量浓度。当CI＜1时，表示两药有协同作用；当CI＝1时，表示最终的作用为两药加和效应；当CI＞1时，表示两药有拮抗作用[23]。
由图3可知，对于不同质量浓度GDVs，2种细胞存活率都在95%以上，表明GDVs对2种细胞的毒性均较低，适合作为药物的递送载体。GPMC- GDVs对2种细胞的IC50分别为7.74、10.70 μg/mL（Mel质量浓度），不论SMMC-7721或HepG2细胞，GPMC-GDVs都表现出优于Mel和GP的抗肿瘤增殖活性。通过计算GP和Mel的CI，当达到50%抑制率时，对于SMMC-7721和HepG2细胞，GPMC的CI分别为0.93和1.06，接近于1，表明GPMC对2种细胞的毒性仅是加和效应，而GPMC-GDVs的CI分别为0.56和0.57，小于1，表明在GPMC- GDVs中GP和Mel起到协同抗肿瘤的作用，这可能是与GDVs负载后，制剂的稳定性增加，同时增加细胞对制剂的摄取有关。
基于多酚和囊泡在葡萄中分布的异域性，本研究首先分离出葡萄皮与葡萄籽中的GP以及葡萄果肉中的GDVs组分，并利用多酚对多肽的聚集作用和囊泡的负载能力，重组构建载蜂毒肽的葡萄囊泡GPMC-GDVs，实现葡萄多组分的汇聚和功能集成。制备的GPMC-GDVs分布均匀，稳定性良好。体外细胞毒性试验研究表明葡萄功能囊泡与蜂毒肽联合使用时具有更好的肿瘤抑制作用。
毒性多肽是很多动物类中药，如全蝎、蜈蚣、水蛭等的主要活性成分，这些动物药常被应用于临床抗肿瘤的组方和治疗，并被现代医学确证其抗肿瘤机制，具备很强的新药开发价值。然而，多肽类成分体内稳定性差，血中半衰期较短，用药后短时间内就被清除或降解，需要频繁给药才能达到治疗剂量，给临床治疗带来诸多不便[24-25]。此外，其较强的溶血性、免疫原性和非选择性细胞毒性存在较大的毒副作用风险[26]，限制了其进一步开发应用。本课题组前期利用中药鞣质能聚集蛋白的性质，开发出多酚-蜂毒肽复合物，能明显改善多肽的稳定性，有效屏蔽表面正电荷，降低细胞毒性，同时表现出较好的协同抗肿瘤效果[27]。本实验在此基础上，将空间异域的葡萄多酚和囊泡组分整合重构，同时完成了毒性多肽的复合和纳米化装载，制备的类脂质结构在载药性能和药效发挥方面均呈现良好的操作性和优势，具有较好的研究价值。
参考文献（略）
来 源：张 蕾，乔宏志，何凤军，方 栋，吴文瀚，狄留庆.葡萄多组分重组囊泡的制备及其载多肽性能研究 [J]. 中草药, 2018, 49(12):2793-2800.
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