摘要：目的 研究花椒毒素及其同分异构体对药物代谢酶细胞色素P450（CYPs）的抑制差异。方法 采用计算机虚拟技术研究花椒毒素及其同分异构体香柑内酯、异佛手柑内酯与6种CYPs酶（CYP1A2、CYP2D6、CYP3A4、CYP2C19、CYP2C9、CYP2A6）的相互作用；采用Amber（ff99SB）软件进行花椒毒素、香柑内酯、异佛手柑内酯与CYP2A6的动力学模拟研究；采用“Cocktail”药物探针法进行验证，分别测定这3种同分异构体对人肝微粒CYPs酶活性的影响，以及对CYP2A6与CYP1A2的半数抑制浓度（IC50）。结果 计算机模拟技术结果显示，花椒毒素、香柑内酯、异佛手柑内酯对6种CYPs结合能力不同，对CYP2A6的结合能力差异明显。分子对接、分子动力学结果表明，花椒毒素与CYP2A6形成的氢键ASN297∶HD22-M∶O4是花椒毒素与CYP2A6结合过程中最重要的且稳定的氢键，香柑内酯与ASN297产生的分子间氢键稳定性低于花椒毒素体系，异佛手柑内酯在动力学中所产生的氢键均不稳定；受体活性口袋中疏水性氨基酸与口袋形状互补是促成配体受体结合的重要因素。“Cocktail”药物探针法表明，花椒毒素、香柑内酯、异佛手柑内酯对CYPs均具有不同程度的抑制作用，其中对CYP1A2具有显著抑制作用，相对剩余酶活力分别为2.67%、4.64%、13.58%，其IC50分别为1.42、2.29、5.12 μmol/L；对CYP2A6的抑制作用存在差异，相对剩余酶活力分别为8.10%、38.91%、74.98%，其IC50值分别为3.89、44.03、103.30 μmol/L。结论 花椒毒素、香柑内酯、异佛手柑内酯对CYP1A2具有明显的抑制作用，对CYP2A6的抑制效果存在明显差异。甲氧基的取代位置与呋喃环骈合的位置对3种化合物与CYP2A6结合影响较大，其中CYP2A6活性口袋中ASN297是蛋白受体与配体结合的关键氨基酸残基。
同分异构体大量存在于中药或天然药物中，研究表明，同分异构体尤其是光学异构体在药理、药动学方面存在很大差异。花椒毒素、香柑内酯、异佛手柑内酯属呋喃香豆素类同分异构体，结构如图1所示，这3种成分在临床常用中药北沙参、白芷、独活中均有发现［1-3］，也存在于蔬菜、水果、植物油中［4-6］。
呋喃香豆素具有广泛的药理活性，在治疗肿瘤、抗炎、抗人体免疫缺陷病毒（HIV）方面具有显著优势［7-8］。现代药理学证明，花椒毒素和香苷内酯具有保护心肌细胞缺氧复氧损伤、抗氧化［9］、诱导胃癌细胞凋亡［10］、抗肿瘤的作用［11-12］。补骨脂素、佛手内酯可抑制淋巴细胞中HIV-1复制，具有抗HIV-1活性，具有良好的成药前景［13］。目前研究表明，由呋喃香豆素类化合物引发的药物-药物相互作用，主要可概括为对肠道P-糖蛋白（P-gp）和细胞色素P450（CYP450，简称CYPs）的抑制作用，其中对CYPs代谢酶的抑制作用是主要方面［14］。本实验以3种同分异构体对CYPs代谢酶抑制活性为标准，借助计算机虚拟技术研究花椒毒素及其同分异构体对CYPs的抑制作用差异。
1 材料
1.1 计算机虚拟系统
采用Discovery Studio（DS，V4.5）进行分子对接研究，Amber（ff99SB）进行分子动力学模拟研究。
1.2 药品与主要试剂
花椒毒素（质量分数98%、货号M1113AS）、香柑内酯（质量分数98%、货号A0402AS）、异佛手柑内酯（质量分数98%、货号J1026AS）、氯唑沙宗（质量分数98%、货号A0206AS）、奥美拉唑（质量分数99%、货号N0708AS）、甲苯磺丁脲（质量分数99%、货号S0806AS），均购自美仑生物科技有限公司；非那西丁（质量分数98%，货号AF20070103）、卡马西平（质量分数98%，货号AF20070102）、香豆素（质量分数98%，货号AF20042951），均购自成都埃法生物科技有限公司；右美沙芬（质量分数98%，货号00367-201305）、咪达唑仑（质量分数98%，货号171270-201402）、对乙酰氨基酚（质量分数98%，货号100018-201610），购自中国食品药品检定研究院；去甲右美沙芬（质量分数98%，货号6700-34-1，Sigma）；1-羟基咪达唑仑（质量分数98%，货号FD050034-02，Cerilliant）；5-羟基奥美拉唑（质量分数98%，货号H948863，Toronto Research Chemicals）；4-羟基甲苯磺丁脲（质量分数98%，货号1-PSB-27-2，Toronto Research Chemicals）；6-羟基氯唑沙宗（质量分数98%，货号6-QFY-28-2，Toronto Research Chemicals）；7-羟基香豆素（质量分数98%，货号wkq16072703，四川省维克奇生物科技有限公司）；人肝微粒体（HLMs）购于瑞德肝脏疾病研究（上海）有限公司（SUBK）；DMSO、NADPH购于美国Sigma公司（货号710N034、40836329）；甲醇、乙腈（色谱纯）、甲酸溶液等购于天津康科德科技发展有限公司；所有其他溶剂和化学试剂均为分析纯或以上。
1.3 实验仪器及耗材
十万分之一天平（型号AX205，瑞士MettlerToledo公司）；微型旋涡混合仪（型号WH-3，上海沪西分析仪器厂有限公司）；高速离心机（型号ALLEGRA-64R，美国Beckman公司）；美国安捷伦公司6520 Q-TOF LC/MS，MassHunter B.02.01SP3色谱工作站；Millipore Milli-Q/30L超纯水机（法国Millipore公司）；电子恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；DKB-501A型超级恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）；海尔-86 ℃超低温保存箱（青岛海尔股份有限公司）；96、48孔培养板（Corning公司）；微量移液器（10、100、200、1 000 μL，Eppendorf）。
2 方法
2.1 花椒毒素、香柑内酯、异佛手柑内酯与CYPs对接的研究
2.1.1 配体结构的准备 从PubChem数据库中下载花椒毒素（PubChem CID：4114）、香柑内酯（PubChemCID：2355）、异佛手柑内酯（PubChem CID：68082）。在DS中运行Minimazizeligand程序，对配体施加CharMmforcefield立场，优化配体小分子。
2.1.2 受体结构准备 从Protein Data Bank数据库下载CYP1A2（PDB ID：2HI4）、CYP2D6（PDB ID：5TFT）、CYP3A4（PDB ID：4NY4）、CYP2C19（PDB ID：4GQS）、CYP2C9（PDB ID：10G5）、CYP2A6（PDB ID：1Z11）晶体结构。在DS中运行Prepareprotein程序优化蛋白结构（加氢、去除无用水分子、补全肽链）。
2.1.3 参数设置 在DS中运行半柔性分子对接程序CDOCKER，为确保docking pose的多样性，设置Pose Cluster Radius参数为0.5 Å（1 Å＝0.1 nm），其余参数默认。活性位点为靠近CYP酶铁卟啉环附近的空腔，符合PDB文献记录的位置。
2.1.4CDOCKER综合打分一致性评价方法的建立 以往研究中，分子对接多采用系统默认的打分函数-CDOCKER Energy Score来评判配体与受体的结合能力。而本研究中花椒毒素、香柑内酯、异佛手柑内酯这3种化合物属于同分异构体，分子骨架、电荷分布、分子内能基本相同，仅结构上有细微差别。因此在研究结构相差不大的分子与蛋白作用时，单一采用一种打分函数作为评判标准结果并不可靠。本实验采用多种打分函数对对接结果进行评分，然后对各种函数的结果进行一致性评价，每一种打分的得分越高，一致性评价也就越高。本实验选用了LigScore1、LigScore2、-PLP1、-PLP2、Jain、-PMF、-PMF04、-CDOCKEREnergy Score这几种打分函数对分子对接产生的10个构象进综合打分一致性评价。
2.2 花椒毒素、香柑内酯、异佛手柑内酯与CYP2A6复合物的动力学模拟研究
取“2.1”项分子对接的结果作为动力学模拟的初始构象，分子动力学模拟使用的是Amber（ff99SB）软件，模拟温度298 K，模拟时间20 ns。使用最小二乘法拟合蛋白质主链分子的均方根偏差（RMSD）值。采用CPPTRAJ软件（https：//github.com/Amber-MD/cpptraj）计算保守氨基酸之间的空间距离。选取最后4 ns MD轨迹拍摄的构象用于MM/PBSA计算。用Amber18计算配体与蛋白质的结合自由能。ΔG值确定根据方程ΔG=Gcomplex－Greceptor－Gligand计算得到。
2.3 花椒毒素及其同分异构体对人肝微粒体CYPs酶活性的影响
2.3.1Cocktail探针药物法的建立 药物对CYPs酶活性影响评价研究中，探针底物法是一种广泛的使用方法［15］。“Cocktail”探针药物法是同时给予2种或2种以上的相对低剂量的探针药物，测定生物样本中每个探针药物的代谢率或者其他代谢类型的指标，以获得多个代谢酶的表型信息。
根据文献报道方法［16］并加以改进，其中CYP1A2的底物为非那西丁（10 µmol/L），CYP2A6底物为香豆素（5 µmol/L），CYP2D6底物为右美沙芬（2.5 µmol/L），CYP3A4底物为咪达唑仑（5 µmol/L），CYP2C9底物为甲苯磺丁脲（100 µmol/L），CYP2C19底物为奥美拉唑（10 µmol/L）。色谱柱为Agilent ZORBAX XDB-C18（50 mm×2.1 mm，3.5 μm，SN： USHP004037）；进样量10 µL；检测波长280 nm；体积流量0.45 mL/min；离子源参数：Curtain Gas为957.6 Pa；IonSpray Voltage 5 000 V（ESI+）、-4 200 V（ESI-）；Ion Source Gas1和Ion Source Gas2分别为2.63、2.39 kPa，离子源温度为350 ℃。待测成分和内标的质谱检测参数见表1。
2.3.3 IC50值的测定 实验条件与上述Cocktail法相同，不同的是3种化合物的终浓度为0、0.3、1、3、10、30、100、300 µmol/L，探针底物使用非那西丁（10 µmol/L）和香豆素（5 µmol/L）。通过 GraphPad Prism version 5.0（GraphPad software Inc，CA，美国）软件拟合出药物对酶活性的IC50值。
3 结果
3.1 花椒毒素及其同分异构体与CYPs的分子对接研究
3.1.1 方法学评估 为确保对接结果的可靠性，需将下载的蛋白活性位点内的配体取下，利用“2.1”项中的方法，将配体重新对接进入该活性位点，再对比得分最高的构象与原始构象的RMSD值判断该方法是否可以重现配体的原始晶体结构。
一致性得分最高的构象与原始配体的叠合效果见图2，RMSD值见表2。该方法对CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4、CYP2D6、CYP2A6原始配体的晶体结构均具有良好的重现性，在接下来的实验中将采用这种对接方法。
3.1.2 花椒毒素及其同分异构体与CYPs的分子对接得分 采用“2.1”项中方法对花椒毒素、香柑内酯、异佛手柑内酯与CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4、CYP2D6、CYP2A6进行了分子对接，其一致性得分如表3所示。花椒毒素、香柑内酯、异佛手柑内酯与CYPs结合的一致性评价均大于等于1，证明在上述的几种打分函数中，至少有一种打分函数认为该化合物能与蛋白产生结合。
3个同分异构体与CYP2A6对接的一致性评分分别为7、4、1，差异明显。为了研究3个同分异构体与CYP2A6结合方式的差异，表4中列出了3种化合物与CYP2A6的结合方式。图3所示3个同分异构体在CYP2A6活性口袋中的构象与2D图。对接结果显示，花椒毒素能与CYP2A6活性中心的ASN297产生一个常规氢键，键长1.88 Å，两个碳氢键，键长分别为2.24、2.41 Å；香柑内酯不能与CYP2A6产生常规氢键，只能与CYP2A6活性中心的ASN297产生一个碳氢键，键长2.36Å；异佛手柑内酯不能与CYP2A6产生任何分子间氢键。
除此之外，CYP2A6活性口袋中有2个PHE（PHE117、PHE118）和辅酶HEM500，这些分子中都具有环状结构会与苯环等环状结构形成Pi-Pi Tshaped相互作用。这3个同分异构体均具有苯骈α吡喃酮结构，能与活性口袋发生Pi-Pi T shaped相互作用，从而占据活性口袋。为进一步考察对接体系与分子间氢键的的稳定性，本实验对3个对接体系进行了分子动力学模拟。
3.2 花椒毒素及其同分异构体与CYP2A6结合的分子动力学模拟研究
3.2.1 分子动力学模拟稳定性的探究 分别对受体CYP2A6体系和所有的蛋白-配体复合物体系CYP2A6-花椒毒素、CYP2A6-香柑内酯、CYP2A6-异佛手柑内酯进行20 ns的分子动力学模拟。为了确定分子动力学模拟结果的稳定性，在各个体系中均以其初始蛋白构象为参照，在模拟时间内对系统Cα原子的RMSD进行计算。结果如图4所示，CYP2A6-花椒毒素、CYP2A6-香柑内酯、CYP2A6-异佛手柑内酯的平均RMSD值为1.52、1.47、1.53 Å，证明动力学动态模拟轨迹平衡性是可靠的，可用于后续进一步分析。
3.2.2 各体系分子间氢键稳定性分析 复合物体系中配体与受体之间的氢键稳定性可以反映出配体与受体之间相互作用的强弱，针对3种复合物体系进行氢键稳定性分析，结果见表5。在整个动力学模拟过程中，共采样20 000 ps数据。花椒毒素与CYP2A6形成的氢键ASN297∶HD22-M∶O4出现12 909 ps，占有率为64.54%，平均距离为2.84 Å，平均角度为154.93°，是花椒毒素与CYP2A6结合过程中最重要的且稳定的氢键。香柑内酯与ASN297产生的分子间氢键在动力学中共出现10 122 ps，占有率为50.61%，低于花椒毒素体系，异佛手柑内酯在动力学中所产生的氢键均不稳定。
3.2.3 各体系结合自由能的计算 蛋白和小分子的结合自由能可以从能量的角度表征受体与配体之间键合的能力。结合能负值越大，表明键合能力越强，破坏该键所需能量也就越大。选取3个体系最后4 ns进行相对结合自由能计算，结果见表6。3个同分异构体化合物与CYP2A6之间的结合自由能均为负值，说明3种化合物均能与CYP2A6产生结合。将结合自由能进行分解，范德华相互作用（Gvdw）、静电相互作用（Gele）和非极性溶剂化自由能（Gesurf）均为负值，说明Gvdw、Gele、Gesurf这3种相互作用能够诱导配体受体结合，而极性溶剂化自由能（Gegb）为正值说明其不利于配体分子结合到受体蛋白中。从表中还可知，Gvdw对配体受体结合最为显著，由此可以判断，受体活性口袋中疏水性氨基酸与口袋形状互补是促成配体受体结合的重要因素。
3.3 花椒毒素及其同分异构体对CYPs酶的抑制
如图5、6所示，花椒毒素、香柑内酯、异佛手柑内酯对CYPs均有不同程度的抑制，在5和50 μmol/L时均对CYP1A2显示出非常明显的抑制作用。在NADPH存在下，花椒毒素、香柑内酯、异佛手柑内酯浓度为50 μmol/L时，CYP1A2的相对剩余酶活力分别为2.67%、4.64%、13.58%，IC50值分别为1.419、2.289、5.124 μmol/L，表明3个同分异构体对CYP1A2均有较强的抑制作用；CYP2A6的相对剩余酶活力分别为8.10%、38.91%、74.98%，IC50值分别为3.893、44.03、103.30 μmol/L。体外酶的抑制实验，进一步验证了分子对接和分子动力学结果的可靠性。
4 讨论
4.1 花椒毒素及其同分异构体构效关系的探讨
本实验使用的是半柔性分子对接方式，在分子对接过程中固定了受体活性口袋的形状，更有利于分析因配体的结构不同而导致作用方式差异的原因。从表4中可以看出，3个同分异构体均能与CYP2A6活性口袋中的PHE118、PHE107、HEM500 产生Pi-Pi T shaped相互作用，与VAL117、ILE300产生Pi-Alkyl相互作用。因此不难看出，3个同分异构体与CYP2A6结合产生差异的主要原因是分子间氢键的作用。
从图3可以看出，甲氧基与呋喃环取代的位置不同和活性口袋的空间特征是造成差异的主要原因。CYP2A6活性口袋切面大致成三角形，A侧空间较大而B侧空间较小。对于线型分子花椒毒素与香柑内酯，由于CYP2A6口袋中B侧没有足够的空间，使得甲氧基只能存在于A侧。花椒毒素上的甲氧基属于8位取代，与羰基在同侧；香柑内酯上的甲氧基属于5位取代，与羰基在异侧，所以花椒毒素的羰基会靠近ASN297形成氢键，香柑内酯的羰基远离ASN297不会形成分子间氢键。对于异佛手柑内酯，其7，8位骈合呋喃环属于角型分子，呋喃环、吡喃酮环、甲氧基在空间位置上组成三角形结构，由于呋喃环小、吡喃酮环与甲氧基形成的角度较大，所以呋喃环进入B侧较小的空间，吡喃酮环与甲氧基在口袋A侧，与此同时PHE117、PHE118与结构中吡喃酮环产生Pi-Pi T shaped相互作用最终导致吡喃酮环在左侧，甲氧基在右侧。正是由于这种几何特征导致异佛手柑内酯不会与口袋中任何氨基酸残基形成稳定的分子间氢键，这是其结合能力较差，对CYP2A6的抑制能力低的主要原因。
分子动力学模拟充分模拟了人体内生理环境，计算过程考虑到受体蛋白的柔性。在考虑到蛋白柔性后，发现香柑内酯在动力学模拟过程中也可以与ASN297产生氢键作用但稳定性低于花椒毒素与CYP2A6产生的氢键，异佛手柑内酯则不会产生稳定的分子间氢键。在动力学模拟中，3种同分异构体与分子对接构象大致类似，对于线型分子花椒毒素、香柑内酯，甲氧基均在A口袋，角型分子香柑内酯的吡喃酮环均在A口袋，进一步阐明了分子对接的结果。通过氢键稳定性分析与计算相互作用能，推测出CYP2A6口袋中疏水性氨基酸与ASN297为关键氨基酸残基，与分子对接结果相同。从上述实验中不难看出，呋喃环的骈合位置与甲氧基的取代位点是造成这3种同分异构体活性差异的根本原因。6，7位骈合呋喃环（花椒毒素、香柑内酯）更容易与CYP2A6的活性口袋产生稳定结合，当7，8位骈合呋喃环（异佛手柑内酯）将大大降低化合物与CYP2A6的结合能力；当5位引入甲氧基时（香柑内酯），由于空间效应的影响，减弱化合物与CYP2A6的结合能力。
宋志英等［16］研究了花椒毒素及其同分异构体与溶菌酶LYSO的结合机制，结果同样表明呋喃环和甲氧基位置的不同导致了4种呋喃香豆素类药物与LYSO的作用强弱不同，其作用力顺序依次为8-甲氧基补骨脂素（花椒毒素）＞5-甲氧基补骨脂素（香柑内酯）＞异补骨脂素（异佛手柑内酯）＞补骨脂素。不难发现，在呋喃香豆素中，呋喃环的骈合位置与5，8位取代将对其药理活性具有较大影响。
4.2 花椒毒素及其同分异构体对药物代谢的抑制作用
花椒毒素及其同分异构体具有广泛的药理活性和良好成药前景，因此研究这3个同分异构体对CYPs的影响是评估药物相互作用和临床不良反应的重要组成部分［17］。肝微粒体CYPs具有广泛的底物特异性，是药物与外源性物质Ⅰ相代谢的重要场所，约有60%的处方药经CYPs酶代谢，是参与药物代谢的主要酶，在药物代谢酶中起至关重要的作用［18］。由于药物对CYPs的诱导或抑制而产生的药物-药物相互作用（DDI）是多种药物被撤市的主要原因。其中CYPs抑制剂所导致DDI的临床意义远大于酶诱导作用。有研究发现，CYPs的抑制剂可增加体内经CYPs代谢的药物浓度，使药物代谢减慢、作用时间增长，从而延长药物在体内处置时间［19-20］。因此，CYPs酶的活性将会直接影响经其代谢药物的药动学从而增加药物在使用过程中产生不良反应的可能，引起严重的DDI，影响药物治疗的安全性和有效性。
“Cocktail”实验结果表明，3种化合物均对CYP1A2产生明显的抑制作用。CYP1A2是一种重要的CYPs，主要分布在肝脏中，其含量排名第3［21］。CYP1A2参与咖啡因、普萘洛尔、硝苯地平等20多种药物的代谢过程，同时也负责一些内源性激素如褪黑激素、胆红素、雌二醇的羟化反应［20］。因此含有这3种成分的药物和食物应避免与主要经CYP1A2代谢的药物同时服用而发生相互作用或不良反应。CYP2A6在尼古丁氧化代谢中起重要作用，主要参与甲硝唑、替加氟、来曲唑等临床常用药物的代谢。研究表明，CYP2A6是人肝微粒体中最主要、可能也是唯一参与香豆素7-羟化反应的酶［22］。因此含有花椒毒素的药物在临床使用中应尽量避免与含有香豆素、经CYP2A6代谢的药物同时使用产生DDI，为临床联合用药提供参考。
4.3 计算机虚拟技术在构效关系研究的展望
药物的生物学活性及代谢特征与其分子结构密切相关，绝大多数药物通过与体内靶点结合从而产生药效。在结合过程中，需要药物分子和体内靶点满足几何匹配与能量匹配，由于小分子药物和靶点蛋白具有一定的柔性，因此在两者相互作用过程中契合程度越高的体系往往特异性和生物活性越强。同分异构体化合物，虽然具有相同的分子式，大致相同的母核结构，但是由于取代基位置的不同，在很大程度上将影响其与靶点蛋白的契合程度。特别是具有手性中心的化合物，当其对映体与受体分子满足契合具有较强的生物活性，那么另一对映体必然因为不能满足契合从而活性大大降低。例如氧氟沙星、吲哚美辛均为S异构体活性分子，而R异构体没有活性［23］。
在以往的构效关系研究中［24-26］，多采用生物学实验结合光色谱的研究方法，前者通过生物学实验获得目标分子的生物学性质；后者通过分析的方法获得目标分子的结构特征，综合前两部分实验结果进行论述与猜测。而计算机虚拟技术的应用更加直观地描述药物结构与受体的契合关系，能直接“看到”分子结构上的差异是如何影响其与靶点的作用方式，也可直接清楚阐明药物的结构特征与其生物学活性关系，即定量构效关系（Q-SAR），并且能对即将开展的生物实验进行指导。
花椒毒素及其同分异构体香柑内酯、异佛手柑内酯对CYP1A2具有明显的抑制作用，对CYP2A6的抑制效果存在明显差异。其中，甲氧基的取代位置与呋喃环骈合的位置对3种化合物与CYP2A6结合能力具有较大影响，CYP2A6活性口袋中ASN297与花椒毒素2位羰基在整个动力学过程中表现非常稳定，是蛋白受体与配体结合的关键氨基酸残基。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：刘世豪，王丽莉，刘文莉，靳超群，陈佳萍，何新. 基于计算机虚拟技术研究花椒毒素及其同分异构体对细胞色素P450的抑制作用差异 [J]. 药物评价研究, 2021, 44(1):15-24.
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