玉兰叶中1个新的四氢呋喃型木脂素

摘  要：目的  研究玉兰Magnolia denudata叶的木脂素类化学成分。方法  采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱以及半制备HPLC等色谱方法进行分离纯化，根据波谱数据鉴定化合物的结构，并采用脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞NO生成模型对分离得到的化合物进行抗炎活性筛选。结果  从玉兰叶95%乙醇提取物中分离得到2个四氢呋喃型木脂素和3个苯并呋喃型木脂素，分别鉴定为 (7S,7′R,8S,8′S)-3,4,5-三甲氧基-3′,4′-亚甲二氧基-7,7′-环氧木脂烷（1）、蔚瑞昆森（2）、liliflol A（3）、liliflol B（4）和5-methoxyliliflol B（5）。结论  化合物1为新化合物，命名为玉兰木脂素A，化合物5为新天然产物，同时首次报道化合物3～5的¹³C-NMR数据。化合物5对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO具有一定的抑制作用，在50μmol/L浓度下其抑制率为48.7%。

玉兰Magnolia denudata Desr.为木兰科（Magnoliacea玉兰花蕾是中药辛夷的重要来源之一，具有散风寒、通鼻窍的功效，可用于治疗风寒头痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻渊^[2]。文献报道木脂素是该植物的主要特征成分，具有抗氧化、抗炎、抗血小板活化、减肥等作用^[3-10]。为促进玉兰植物资源的综合开发与利用，本实验对采自云南昆明的玉兰叶开展深入的化学成分研究，从中分离得到5个木脂素类化合物，分别鉴定为(7S,7′R,8S,8′S)-3,4,5-三甲氧基-3′,4′-亚甲二氧基-7,7′-环氧木脂烷 [7S,7′R,8S,8′S-3,4,5-trimethoxy-3′,4′-methylenedioxy-7,7′-epoxylignan, 1]、蔚瑞昆森 （veraguensin, 2）、liliflol A（3）、liliflol B（4）和5-methoxyliliflol B（5），结构见图1。其中化合物1为新化合物，命名为玉兰木脂素 A，化合物5为新天然产物，并首次报道化合物3～5的¹³C-NMR数据。体外活性评价表明，化合物2、3、5均具有不同程度的抗炎活性，在50 μmol/L的浓度下对LPS诱导RAW264.7细胞生成NO的抑制率分别为14.3%、21.7%、48.7%。

1  仪器与材料

Bruker Avance III500 MHz（Bruker公司，瑞士）；Bruker Tensor-27傅里叶变换红外光谱仪（Bruker公司，德国）；Shimadzu UV-2401A紫外可见分光光度仪（Shimadzu公司，日本）；Jasco P-1020全自动数字旋光仪（Jasco公司，日本）；Agilent 1260高效液相色谱仪（Agilent公司，美国）；色谱柱为Zorbax SB-C₁₈（Agilent，150 mm×9.4 mm,5 µm，美国）；柱色谱硅胶（临沂市海祥化工厂，100～200、200～300目）；GF₂₅₄薄层色谱硅胶板（临沂市海祥化工厂）；Sephadex LH-20（Pharmacia公司，瑞典）；显色剂（10%硫酸乙醇溶液，喷洒后适当加热）；色谱甲醇（北京百灵威科技有限公司）；分析甲醇（天津市风船化学试剂科技有限公司）；所有溶剂均为工业溶剂重蒸后使用。小鼠单核巨噬细胞RAW264.7购自中国科学院上海细胞库，DMEM培养基和胎牛血清购自美国Hyclone公司，Griess Reagent、LPS和MG132购自Sigma公司。

玉兰于2017年12月采自云南昆明，并由中国科学院昆明植物研究所成晓副研究员鉴定为玉兰Magnoliadenudate Desr的干燥叶，标本（20170602m）存放在中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部资源持续利用国家重点实验室。

2  提取与分离

玉兰干燥叶2 kg，粉碎后用95%乙醇冷浸提取（3次×48 h），合并提取液，减压蒸馏除去有机溶剂，将提取物分散于水中用醋酸乙酯萃取3次，回收溶剂后，得醋酸乙酯部分60 g，经反相MCI柱色谱，以甲醇-水（45∶55→100∶0）梯度洗脱，经TLC检测，合并相同部分得Fr. 1～14。Fr. 8（2.5 g）经正相硅胶柱色谱，以氯仿-丙酮（400∶1→1∶1）洗脱得到Fr. 8.1～8.7。Fr. 8.7（346 mg）进一步经正相硅胶柱色谱，以石油醚-醋酸乙酯（9∶1）洗脱得到Fr. 8.7.1～8.7.4。Fr. 8.7.2（213 mg）经正相硅胶柱色谱[石油醚-丙酮（50∶1）]洗脱得到化合物3（11.3 mg）和4（8.0 mg）。Fr.8.7.3（26 mg）经Sephadex LH-20[氯仿-甲醇（1∶1）]洗脱得到5（6.4 mg)。Fr.9（1.9 g）经正相硅胶柱色谱，以石油醚-丙酮（400∶1→1∶1）洗脱得到Fr. 9.1～9.6。Fr. 9.5（54 mg）经Sephadex LH-20（甲醇）洗脱得到2（30.5 mg)。Fr. 9.6（118.0 mg）经正相硅。

3  结构鉴定

化合物1：无色油状物，[α] 56.0 (c 0.10, MeOH)； 200 (4.09), 257 (3.49), 284 (3.87)；ECD (c 0.65 mmol/L，MeOH) λ_max [Δε/(L·mol⁻¹·cm⁻¹)]: 209 (＋4.83), 234 (＋0.46), 279 (＋0.26) nm。根据其HRESIMS，准分子离子峰为m/z:409.162 3 [M＋Na]^＋，计算值为409.162 2）和¹³C-NMR数据推断其分子式为C₂₂H₂₆O₆，不饱和度为10。在其IR光谱中显示该化合物存在特征的苯环（1 591、1 505、1 456 cm⁻¹）官能团信号峰。从¹H-NMR谱（表1）可知，该化合物含有1组ABX系统芳香

质子信号[δ_H 6.89 (1H, s, H-2′)，6.77 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5′)，6.79 (1H, d, J = 8.2 Hz,H-6′)]，1组对称芳香质子信号 [δ_H 6.73(2H, s, H-2, 6)]，3个甲氧基 [δ_H 3.90 (6H,s, 3, 5-OCH₃), 3.86 (3H, s, 4-OCH₃)]，2个甲基[δ_H 1.08 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-9)，0.67 (3H, d, J = 7.0 Hz,H-9′)] 和1个亚甲二氧基 [δ_H 5.95(2H, s)]。¹³C-NMR谱（表1）显示了22个碳信号，分别为3个甲氧基、2个甲基、1个亚甲二氧基、9个次甲基（包括5个sp²杂化次甲基）以及7个sp²杂化的季碳。上述数据表明该化合物为四氢呋喃型木脂素。在HMBC谱（图2）中δ_H3.90(3, 5-OCH₃) 与δ_C153.2 (C-3, 5)，δ_H 3.86 (4-OCH₃)与δ_C 137.4 (C-4)，δ_H 6.73 (H-2, 6) 与δ_C 153.2 (C-3, 5), 137.4 (C-4) 有远程相关，确定化合物1中1个芳环为3, 4, 5-三甲氧基苯基。δ_H6.89 (H-2′), 6.77 (H-5′), 6.79 (H-6′)与δ_C135.1 (C-1′)，δ_H 6.89 (H-2′) 与δ_C 146.6 (C-4′)，δ_H 6.77 (H-5′) 与δ_C 147.5 (C-3′)，δ_H 5.95 (-OCH₂O-) 与δ_C 147.5 (C-3′), 146.6 (C-4′) 的HMBC相关，表明该化合物中另一个芳环为3′, 4′-亚甲二氧基苯基。¹H-¹H COSY谱中H-7/H-8/H-8′/ H-7′相关，结合C-7 (δ_C 87.5)和C-7′ (δ_C83.2) 位碳谱数据和该化合物不饱和度分析，可知化合物1含有1个四氢呋喃环。HMBC谱（图2）中δ_H4.37 (H-7)与δ_C 136.5 (C-1), 103.4 (C-2, 6)、δ_H 5.11 (H-7′) 与δ_C 135.1 (C-1′), 107.5 (C-2′), 120.2(C-6′) 相关，提示3, 4, 5-三甲氧基苯基和3′, 4′-亚甲二氧基苯基分别连在C-7和C-7′位。H-8/H₃-9和H-8′/H₃-9′的¹H-¹H COSY相关，以及δ_H 1.08 (H₃-9), 0.67 (H₃-9′)与δ_C 48.1 (C-8), 46.0 (C-8′) 的HMBC相关，表明两个甲基分别连在C-8和C-8′位。因此，化合物1的平面结构得到确定，如图2所示。

化合物1的相对构型可通过分析ROESY谱加以确定。ROESY谱中H-7/H-7′、H-7/H₃-9、H-7/H-8′、H-2′/H₃-9′、H-8′/H₃-9相关（图2），表明H-7、H₃-9，H-7′、H-8′在同一侧为β朝向，H₃-9′在另一侧为α朝向。化合物1的绝对构型通过比较1和2的圆二色谱（ECD）数据得到确定。化合物2的结构在本研究中通过和文献中报道的¹H-和¹³C-NMR数据进行比较确定为veraguensin^[11-13]，并进一步通过Cu-Kα单晶X衍射技术确定其绝对构型（图3），Flack系数为0.05（2）。化合物1和2圆二色谱图中209和234 nm附近均显示正的Cotton效应（图4），

化合物3和4曾在紫玉兰M. liliflora Desr.中分离得到，通过与文献报道的¹H-NMR和MS数据进行对比分析，分别鉴定为liliflol A和liliflol B^[14]，但未见其¹³C-NMR数据报道。本实验进一步利用HSQC、HMBC、¹H-¹H COSY、ROESY谱图分析确证了化合物3和4的结构，并首次报道其¹³C-NMR数据（表2）。

化合物5：无色油状物，[α] 52.3 (c 0.12, MeOH)；UV (MeOH) λ_max [log ε/(L·mol⁻¹·cm⁻¹)]: 205 (4.51)，258 (3.07)，292 (3.51) nm。根据其HRESIMS（准分子离子峰为m/z: 379.152 0 [M＋Na]^＋，计算值为379.151 6）和¹³C-NMR数据推断其分子式为C₂₁H₂₄O₅，不饱和度为10。从¹H-和¹³C-NMR谱（表2）可知，该化合物含有1个甲基 [δ_H 1.39 (3H,d,   J= 6.7 Hz, H-9)；δ_C 18.2 (C-9)]，3个甲氧基[δ_H 3.86 (6H, s, 3, 5-OCH₃), 3.85(3H, s, 4-OCH₃ )；δ_C56.2 (3, 5-OCH₃), 60.9 (4-OCH₃)]，2个亚甲基（含1个sp²杂化亚甲基），7个次甲基（含5个sp²杂化次甲基），8个sp²杂化季碳，上述数据分析表明该化合物为苯并二氢呋喃型木脂素。通过分析化合物5和3的¹H和¹³C-NMR数据，发现这2个化合物的结构相似，二者的区别在于化合物5中3, 4, 5-三甲氧基苯基取代了化合物3中3, 4-亚甲二氧基苯基。HMBC谱（图6）中δ_H 3.86 (3, 5-OCH₃) 与δ_C 153.4 (C-3, 5)，δ_H 3.85 (4-OCH₃) 与δ_C 137.8 (C-4)，δ_H 6.63 (H-2, 6) 与δ_C 153.4 (C-3, 5), 137.8 (C-4) 相关证实上述推断。ROESY谱（图5）中H-7和H₃-9相关、H-2和H-8相关，说明H-7和H₃-9在同一侧，均为β朝向。文献报道，Aiba等^[15]通过mirandin A的化学转化合成过化合物5，但未见该化合物的碳谱数据报道。本

4  化合物的抗炎活性

利用脂多糖（LPS）诱导刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7为检测模型，通过MTT法测试化合物2～5在50 μmol/L的浓度下对RAW264.7的细胞毒性。进一步通过Griess法检测NO生成量^[16]，测试化合物2～5的抗炎活性。结果表明（表3），除化合物4在50 μmol/L的浓度下对RAW264.7具有一定的细胞毒性，化合物2、3、5对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞释放NO具均有不同程度的抑制作用，其抑制率分别为14.3%、21.7%、48.7%。

5  化合物2单晶X衍射测定

化合物2为无色晶体，采用BrukerD8 Quest单晶X衍射仪（Cu Kα，λ＝0.154 178 nm）测定。实验用晶体大小为（0.700×0.630×0.460）mm³，分子式C₂₂H₂₈O₅，M＝372.44，单斜晶系，晶胞2.990 01 (14) nm，α＝90°，β＝90.387 0(10)°，γ＝90°，晶胞体积：V＝199. 003 (17)nm³，空间群为P1211，晶胞内分子数Z＝4，F(000)＝800，吸收系数μ＝0.707 mm⁻¹，T＝100(2) K，收集衍射点数为35 995，独立衍射点数7 834 [R(int)＝0.037 9]。基于F²全（all data）；拟合优度检验F²＝1.066，Flack系数为0.05（2）。化合物2的CIF文件存放于英国剑桥单晶X衍射数据中心，CCDC编号为2002950。

参考文献（略） 

来  源： 谢章巧，丁林芬，聂  伟，雷  铁，吴双凤，宋流东，吴兴德．玉兰叶中1个新的四氢呋喃型木脂素 [J]. 中草药, 2020, 51(22):5675-5680.