“工欲善其事,必先利其器”,能否做一块好的琼脂糖凝胶,直接影响到后面电泳和结果的分析。制胶前,小科给大家的建议:
1. 在制胶时必须将制胶模具、梳子以及烧杯等物品洗净,以免干胶及其他杂质带入;
2. 在溶胶时应观察溶液中是否有未溶解的琼脂糖颗粒,确保溶胶完全;
3. 在溶液倒入制胶模具前必须充分混匀,以免制出来的胶出现不均匀的现象。
凝胶的浓度是常被忽略问题。小科建议:长片段的DNA选用低浓度的凝胶电泳,短片段的DNA则选用高浓度的凝胶电泳。
表一:分离不同大小的DNA片段所用的最适凝胶浓度
凝胶浓度 | 0.5% | 0.7% | 1% | 1.2% | 1.5% | 2% |
DNA长度 | 1kb-30kb | 800bp-12kb | 500bp-10kb | 400bp-7kb | 200bp-3kb | 50bp-2kb |
要想电泳跑出可见条带的话,至少需要上样50 ng,但是0.5 cm宽的梳子最好不超过0.5μg的DNA量,因为上样量过多会造成加样孔超载,从而导致拖尾或弥散,对于较长的DNA此现象更为明显。另外,加样量的多少还应依据加样孔的大小及DNA片段的长度而定,当加样孔大时,样品上样量应相应加大。
通常情况下电压越低,走出的电泳条带越平整。低电压电泳时,电泳缓冲液也不容易发烫,也能确保在电泳的过程中凝胶不会变形。当然电压太低,等待电泳结果的时间就会延长,综合考虑,一般控制电泳电压≤5V/cm,即可保证电泳条带的清晰度。
一些片段的DNA,电泳20-30min家常便饭,有的甚至需要更长的时间,如果想稍微快一点,可以选用浓度比较稀的凝胶或稍微调高一点电压进行电泳。
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