WB的转膜和染色

为了让固定的蛋白可视化，在相同比例的水/醋酸/甲醇混合物中加入质量比 0.25% 的考马斯亮蓝 R-250，然后将凝胶放置溶液中，在振荡器上室温孵育 4 小时至过夜。接下来将凝胶（保存染料；可重复多次使用）转移到 67.5% 蒸馏水、7.5% 醋酸、25% 甲醇的混合溶液中，放置在振荡器上，洗去多余的染料。

染料不会结合丙烯酰胺，因此会被洗脱（留下干净的凝胶）。但是，染料会与凝胶中的蛋白紧密结合，显示为深蓝色。

铜染色法

用蒸馏水简单冲洗经新鲜凝胶（最多 30 分钟），然后转移至 0.3 M CuCl₂ 溶液染色 5–15 分钟。接下来用去离子水简单清洗凝胶，在暗视野背景下观察。蛋白在半透明蓝色背景下形成清晰条带。凝胶可以用 0.1–0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0 重复冲洗至完全脱色。根据转膜仪器制造商的说明，进行转膜。

转膜

转膜流程的详细说明可在转膜仪器制造商的网站上找到，根据系统的不同而有所区别。但是，每种方法的原理都一样。带电荷的蛋白（SDS 提供）在电场中可以在凝胶中移动，从凝胶转移到膜上，显示蛋白的“印迹”。早期的方法依赖于扩散；现在在电场中进行印迹是标准方法了。

转膜可以湿转或半干转。湿转由于膜的干燥而更不容易失败，尤其推荐用于大蛋白转膜。在两种转膜方法中，膜都放置在凝胶旁边，两者夹在滤纸中间，整个三明治结构夹在固体载体之间，保持凝胶与膜之间的紧密接触。

在湿转中，凝胶和膜紧紧地夹在海绵和滤纸之间（海绵 > 滤纸 > 凝胶 > 膜 > 滤纸 > 海绵），确保凝胶与膜之间不形成气泡。三明治结构浸泡在转膜缓冲液中，对其施加电场。负电荷蛋白向正极移动，结合在膜上，并阻止其继续移动。

湿转的标准缓冲液与跑胶缓冲液所用的都是 1x Tris-甘氨酸缓冲液，但是没有 SDS，并加入了甲醇至终浓度 20%。对于分子量大于 100 kDa 的蛋白，推荐在转膜缓冲液中加入终浓度为 0.1% 的 SDS。

在半干法转膜中，三明治由滤纸 > 凝胶 > 膜 > 滤纸组成，在转膜缓冲液中浸湿，直接放置在正负电极之间。在转膜中，膜靠近正极、凝胶靠近负极，这很重要。

半干转的转膜缓冲液中 Tris 和甘氨酸的比例不一定与湿转一致，请参考仪器制造商的实验方案。标准配方是 48 mM Tris、39 mM 甘氨酸、0.04% SDS、20% 甲醇。

有两种类型的膜：硝酸纤维素膜（NC膜）和 PVDF膜，实验效果都很不错。PVDF 膜要求进行预处理：将膜裁剪为合适的大小，然后在甲醇中浸泡 1–2 分钟。之后转移膜至冰冷的转膜缓冲液中孵育 5 分钟。未能在转膜缓冲液中平衡的膜会导致转印时皱缩、条带错位。

小分子和大分子蛋白的转膜

转膜缓冲液中 SDS 和甲醇的平衡、蛋白的大小、胶的浓度会影响转膜效率。如下调整可以增加转膜效率：

大分子蛋白 (>100 kD)

对于大分子蛋白，其在凝胶电泳时分离迁移较慢，从凝胶中转膜也很慢。因此跑胶时应该使用低浓度的凝胶，8%或更低。由于低浓度的胶易碎，所以操作时需十分小心。

大分子蛋白易在凝胶里形成沉淀聚集，阻碍转膜。在转膜缓冲液加入终浓度0.1%的SDS，可以避免出现这种情况。由于甲醇易使SDS从蛋白上脱落，因此降低甲醇的浓度至10%或更低，可以防止蛋白沉淀。
降低转膜缓冲液中甲醇的比例也会促使凝胶的肿胀，让大分子蛋白更容易转膜。
只有使用NC膜时才必需使用甲醇。如果是 PVDF膜，在甲醇激活膜后，转膜缓冲液中可以不加入甲醇。
选择湿转 4°C 过夜，不建议选择半干转。

小分子蛋白 (<100 kD)

SDS 妨碍蛋白与膜的结合，对于小分子蛋白更是如此。因此小分子蛋白的转膜，转膜缓冲液中可以不加 SDS。
保持甲醇的浓度20%。

对于500 kD 的蛋白，请参考下列文献的凝胶和缓冲液系统：

Bolt MW and Mahoney PA (1997).High-efficiency blotting of proteins of diverse sizes following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis.Anal Biochem, 247, 185–92.

更多转膜提示：

使用镊子，避免手指接触膜。手指上的油和蛋白会阻碍转膜，形成脏的印迹。
将凝胶和膜夹在滤纸中间后，两者之间的气泡可以通过滚筒、移液管或者 15 mL 管滚压三明治结构来去除，或者在装有转膜缓冲液的盘中组装三明治结构，防止气泡形成。
确保将滤纸和膜的大小剪裁得与凝胶一致。在半干转中，较大的突出会阻止电流通过膜。
鸡来源的抗体会结合在 PVDF膜上，形成高背景。改用NC膜可以帮助降低背景染色。

丽春红染色使膜上蛋白可视化

要确定转膜的成功，用 TBST 洗膜。将丽春红母液按照 1:100 稀释。母液是 2% 的丽春红 S 加入 30% 的三氯乙酸和 30% 的磺基水杨酸制成。

在丽春红染色液中孵育 5 分钟，然后用大量水冲洗直至水清澈、蛋白条带显现。该膜可以用 TBST 或水重复冲洗至完全脱色。对于 PVDF 膜，用甲醇重新激活后，再用 TBST 清洗。

TBS 10x

1 L 溶液；
24.23 g Trizma HCl
80.06 g NaCl
在 800 mL 蒸馏水中溶解
用 HCl 将 pH 调至 7.6
将体积加至 1 L

TBST

1 L 溶液；
100 mL TBS 10x
900 mL 蒸馏水
1 mL Tween 20

Tween 20 很粘稠，会粘在枪头上。请确保在 Tris 缓冲液中加入正确的剂量。使用10% 的溶液比直接加入未稀释的 Tween 20 更容易操作。

膜的封闭

封闭膜可以阻碍一抗和/或二抗非特异性的结合到膜上（膜对蛋白有很高的结合能力，因此对抗体也有很高的结合能力）。

通常使用两种封闭溶液：脱脂牛奶或 BSA (Cohn fraction V)。牛奶相对便宜，但是不推荐用于磷酸化蛋白的研究；牛奶中包含的酪蛋白是一种磷酸化蛋白，可能会导致抗体的非特异性结合，形成高背景。

有些抗体对 BSA 封闭的膜比牛奶封闭的膜信号更强，原因还不清楚。查看数据表中的应用说明，看其中是否有封闭的具体说明。

配置 5% 的牛奶或BSA 溶液，即在每 100 mL TBS 含 Tween 20 (TBST) 的缓冲液中加入 5 g 牛奶或 BSA。充分混合并过滤。不过滤可能会导致斑点，在显影时影响条带。

在摇床上 4°C 孵育 1 小时。孵育后用 TBST 冲洗 5 秒。

一抗孵育

孵育缓冲液

以建议稀释度在 TBST 中稀释抗体。如果数据表没有标明建议稀释度，设计稀释梯度 (1:100–1:3000)，并根据结果进行优化。抗体过量会导致非特异性条带。

某些实验室习惯使用封闭缓冲液，而另一些实验室则使用不含封闭剂的 TBST 来孵育抗体。您可能会发现抗体缓冲液加或不加封闭剂，不同的抗体，结果也不尽相同，。

如果没有高背景问题，用低浓度(0.5–0.25%)甚至完全不加牛奶或 BSA，有些抗体会产生更强的信号。

孵育时间

时间可能从几小时到过夜不等（不超过 18 小时），取决于抗体对蛋白的亲和力和蛋白丰度。我们建议抗体更高的稀释度、更长的孵育时间，确保特异性结合。

孵育温度

最好低温孵育。如果在封闭缓冲液中孵育过夜，必须在 4°C 孵育，否则会出现污染从而破坏蛋白（尤其是磷酸化基团）。

建议在摇床上孵育，充分均匀覆盖膜，防止结合的不均匀。

二抗孵育

用 TBST 清洗膜数次，每次清洗 5 分钟或更长，去除残余一抗。

孵育缓冲液与稀释度

以建议的稀释度在 TBST 中稀释抗体。如果数据表没有推荐的稀释度，设计稀释梯度 (1:1,000–1:2,0000)，并根据结果进行优化。抗体过量会导致非特异条带。您可以在封闭缓冲液中孵育二抗，但是在降低背景时可能会牺牲特异性信号的强度，这可能是因为封闭蛋白会阻碍抗体目标蛋白的结合。

孵育时间和温度

摇床上室温孵育 1–2 小时。

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​转膜

丽春红染色使膜上蛋白可视化

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