干货 | 细胞鉴定

57 人阅读 发布时间：2022-10-31 08:49

成瘤性检查，是指为确定细胞基质在动物体内是否能够形成肿瘤，对细胞特性进行的鉴定。与致瘤性检查不同的是，致瘤性检查是指确定细胞基质中是否存在可使细胞永生化并具有形成肿瘤的因子。成瘤性检查针对的是细胞基质，致瘤性检查针对的是细胞因子。
 

需要进行成瘤性检查的细胞

 

1. 新建细胞系/株以及新型细胞基质。

2. 某些传代细胞已证明在一定代次内不具有成瘤性，而超过一定代次则具有成瘤性（如Vero）。

3. 用于疫苗生产的细胞系/株应进行成瘤性检查，但当未经遗传修饰的二倍体细胞被证明无成瘤性后，可以不作为常规检查要求。

注：已证明具有成瘤性的传代细胞（如BHK21，CHO，C127等），或细胞类型属成瘤性细胞（如杂交瘤细胞等），用于生产治疗性产品时可以不再做成瘤性检查。

 

检查方法

目前使用比较广泛的成瘤性检查方法有动物接种法（体内）和软琼脂克隆形成实验（体外）。其中，体内法为评价的标准，但对某些细胞而言，体外法的结果也可以作为细胞成瘤性检查的参考，尤其是低代次、在动物体内无成瘤性的传代细胞系。

1►动物接种法

将待检测细胞接种于皮下或者肌肉内注射。至少观察16周接种部位是否有进行性结节形成，对出现的结节开始消退的动物，应在观察期末处死。不能形成进行性结节的细胞，不视为具有成瘤性。通常用 HeLa 或 HeLa S3细胞或其他已知成瘤性细胞作阳性对照，且对照组至少设10只动物，试验才视为有效。在观察期末，处死所有动物，对注射部位及其他部位 (如心脏、肺、肝、脾、肾、脑及局部淋巴结)进行观察和组织病理学检查，判断是否有接种细胞增生，进一步判定接种细胞是否形成肿瘤或有转移瘤。

►结果判断：

● 如待检细胞接种组10只裸鼠中至少有2只在注射部位或转移部位形成瘤，并且组织病理学及基因型分析显示形成瘤的细胞性质与接种的细胞一致时，则可判定为待检细胞具有成瘤性，视为阳性。

● 如待检细胞接种组10只裸鼠出现结节开始消退，应在观察期末处死。不能形成进行性结节的细胞，不视为具有成瘤性。

2►软琼脂克隆形成实验

使用低熔点琼脂模拟细胞在体内的微环境培养细胞，通常使用其它已知具有成瘤性的细胞作为阳性对照，对照组与实验组同步操作。常规培养3周左右，培养过程中可视情况适当地补充细胞培养液，直到阳性组在显微镜下明显观察到大量细胞集落，培养终止。使用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，在显微镜下观察并拍照记录。

►结果判断：

● 阳性组没有形成明显的大量细胞集落或者细胞在培养过程中或是死亡裂解，又或者被污染，则系统对照不成立。

● 阳性组形成明显的大量细胞集落，则系统对照成立。

● 待检样品没有形成明显的细胞集落，则判断样品细胞没有体外成瘤性；待检样品形成明显的大量细胞集落，则判断样品细胞具有体外成瘤性。
 

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武汉珈创生物技术股份有限公司，创建于2011年，是一家集生物技术服务与研发为一体的高新技术企业，专注于为生物药品/制品的生产企业及研发机构提供各类细胞（含重组细胞、干细胞、免疫细胞等）及原辅料的质量检测、病毒清除工艺验证技术服务。

 

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武汉珈创生物可按相关法规或指导原则提供各类细胞基质的成瘤性检查服务，且有多种检测方法可供选择如动物体内接种法（裸鼠）、软琼脂克隆形成试验、端粒酶活性检测等，至今已完成数万批次的细胞及产品检测服务。

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参考资料：

1、屈哲,林志,霍桂桃,侯田田,杨艳伟,张頔,耿兴超,李波,霍艳.细胞治疗产品的成瘤性和致瘤性风险评价.Chinese Journal of New Drugs 2021,30(19)

2、Ken Kono，Nozomi Takada.Characterization of the cell growth analysis for detection of immortal cellular impurities in human mesenchymal stem cells.Biologicals 43 (2015) 146e149

3、Nozomi Hasebe-Takada , Ken Kono.Application of cell growth analysis to the quality assessment of human

4、cell-processed therapeutic products as a testing method for immortalized cellular impurities .Regenerative Therapy 5 (2016) 49e54

5、Shinji Kusakawa.Ultra-sensitive detection of tumorigenic cellular impurities in human cell-processed therapeutic products by digital analysis of soft agar colony formation.scientific reports

 

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