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http://www.labome.cn/method/Protein-Purification-through-Column-Chromatography.html在结构研究和体外生物化学分析等很多实验应用中都需要用到纯化蛋白质。蛋白质可以从组织中获取,亦或更经常的是从模式生物中过量表达获得,如细菌、酵母或哺乳动物细胞培养等。蛋白质纯化主要是根据它们各不相同的物理性质来从原料进行分离,其目的就是希望能浪费最少的杂蛋白,获得最多的功能蛋白质。一个好的蛋白质的纯化过程必须要将其纯化工艺步骤优化至最少。
图 1. 含Tris碱及其酸式物的Tris缓冲液溶液。Tris 25°C的pKa值是8.06,表示当pH=8.06,50%的Tris是质子化(酸式结构),50%是去质子化(碱式结构)。
本文主要评述了4种蛋白质纯化中最常用的柱层析方法,并对它们各自的优缺点及存在的问题进行了讨论。同时,本文还报道了来邦网(Labome)对98篇相关文献的调研。调研结果表明,主要基于HIS、GST和FLAG标签的亲和层析和体积排阻层析是这些文献中最常采用的方法。GE Healthcare是蛋白质纯化研究中最大的试剂和仪器供应商。
建立蛋白质纯化工艺
建立蛋白质纯化工艺时,最重要的是需要考虑纯化得到的蛋白质应能满足其后续应用要求。蛋白质的数量及纯度都必须满足实验分析要求。而且,因为后续研究需要的是保持良好折叠结构的活性蛋白质,因此蛋白质行为的相关信息也需要考虑。在纯化及后续的保存过程中,很多处理方法都会对蛋白质的性质产生影响,如蛋白质的去折叠、聚集、降解和失活等。制定详细计划,在最短时间内完成蛋白质纯化,并在最稳定的条件下进行保存才算是成功地完成了其整个纯化过程。
图 2. 用于蛋白质自动层析分离的?ktaprime plus系统。来自GE。
缓冲液体系
每一步纯化过程中,蛋白质的溶液环境对其稳定性和活性的保持都非常关键。蛋白质应该保存在一个良好的缓冲液环境中,要避免突然的pH值变化,以其防止对蛋?字收鄣刺⑷芙庑院突钚栽斐刹豢赡娴挠跋臁?
缓冲液是一种含有共轭酸/碱对的水溶液。 缓冲液的pH值范围根据其pKa值决定。该pKa值定义为50%的分子为酸式结构,50%为碱式结构时的pH值 (图1)。关于缓冲液的一个常规原则是,其pH值应保证在pKa值左右1个pH值单位范围内,从而保证其具有良好的缓冲能力。如此可以保证同时有足够的以酸式结构和碱式结构存在的分子在加入 H+ 或者 OH- 时可以将它们中和。这样,缓冲液就可以防止pH变化导致的蛋白质稳定性改变。
图 3. 用于聚组氨酸标签蛋白质选择性纯化的Ni-NTA 配体共价连接交联琼脂糖介质。组氨酸残基可代替结合的水分子与 Ni2+ 离子结合(如红色箭头所示),然后可以利用咪唑或游离组氨酸与 Ni2+ 离子的结合能力代替结合蛋白质,以达到将蛋白质洗脱的目的。来自BioKe。
一种好的缓冲液必须具有以下特征
[1] :
水溶性
化学稳定性
在所需pH范围内良好的缓冲能力
与分析和实验应用条件具有良好的兼容性
与其他溶质具有良好的兼容性
很多物质都可以用于生物缓冲液。最常使用的缓冲液成分通常具有接近中性的pKa值,可在生理pH值范围左右使用。表1列出了4种最常用的生物缓冲液、各自的pH值应用范围及各自可能对蛋白质纯化过程产生影响的优缺点。为保证足够的缓冲能力,这些缓冲液的浓度通常为25mM。
缓冲液pH范围优缺点
磷酸缓冲液5.8-8.0pH值不随温度变化
便宜
紫外无吸收
不能与二价阳离子一起使用
MOPS缓冲液6.5-7.9不能高压灭菌处理
pH值一定程度上随温度变化
在生理pH值范围内具有高缓冲能力
HEPES缓冲液6.8-8.2不能高压灭菌处理
pH一定程度上随温度变化
一定条件下会生成自由基
[2]Tris缓冲液7.5-9.0pH值在一定程度上随温度或稀释程度变化
便宜
会对部分酶活性造成影响
[3] ,
[4]紫外无吸收
表 1 蛋白质纯化中最常用的生物缓冲液。缓冲液在一定pH值范围内可保持它们的缓冲能力,部分缓冲液成分会对某些层析过程或者分析实验造成影响。总结自Promega, Sigma-Aldrich, Applichem, Embl.de.
溶液添加剂
除了一个合适的缓冲液体系,蛋白质纯化过程中——从溶菌到保存——所使用的溶液通常还含有很多其他对蛋白质纯度、稳定性和活性方面均具有一定作用的成分。
溶菌缓冲液和纯化工艺的前期步骤中常常会添加蛋白酶抑制剂以防止目标蛋白质被内源性蛋白酶酶解。而纯化工艺的后期一般不用再添加这些蛋白酶抑制剂,因为此时几乎所有的蛋白酶都已经从目标蛋白质分离出去。蛋白质的保存缓冲液中通常要添加金属螯合剂,如EDTA或EGTA。这些金属螯合剂与 Mg2+结合以防止目标蛋白质被所含的金属蛋白酶分解。还有一些其他的添加剂,主要是用来保护蛋白质不被破坏和增强其溶解性。
类型功能常用试剂
还原剂防止氧化2-mercaptoethanol (BME)
Dithiothreiotol (DTT)
Tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP)
蛋白酶抑制剂防止内源性蛋白酶分解蛋白亮抑肽酶 (丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制剂)
抑胃肽 (天冬氨酸蛋白酶抑制剂)
PMSF (丝氨酸蛋白酶抑制剂)
金属螯合剂使金属蛋白酶失活EDTA
EGTA
精氨酸激酶稳定蛋白质结构,增强溶解性丙三醇
去污剂(如CHAPS,NP-40,Triton X-100)
糖(如葡萄糖、蔗糖等)
离子稳定剂增强溶解性盐类 (如NaCl、KCl、(NH4)2SO4
表 2蛋白质纯化中用于增强蛋白质稳定性的常用添加剂。总结自Thermo Fisher Pierce、Embl.de。
添加剂只在必要时才使用。可能需要多次尝试才能确定某些添加剂是否对一些特定蛋白质的纯化工艺有效。
其他因素
蛋白质纯化工艺中的其他因素也会对蛋白质的稳定性产生影响。对蛋白质的处理步骤越少越好,在最短时间内采用最少步骤的纯化工艺才能保证得到最高产率的活性蛋白质。而且,在整个纯化过程中,蛋白质最好都保持在低温状态。一般纯化过程都在4°C进行,因为这个温度既可以降低酶解速度(在含有蛋白酶的情况下),又可以保证蛋白质的结构完整性。
蛋白质柱层析介绍
柱层析设备
柱层析的基本原理是将一份蛋白质混合物分成很多小份,从而使某些组分中目标蛋白的浓度通过浓缩得以增大。虽然已经有很多昂贵和特殊的设备可用于柱层析,但实际上它只需要最基本的设备即可。
图 4. 用蛋白A、G、L进行亲和层析的原理示意图:A.抗体含有多个功能区:一类蛋白质的Fc区(片段,恒定区) 都是相同的,Fv区(片段,可变区)是每个抗体各不相同的特异区,Fab(片段,抗原区)是抗体实际与特异性抗原结合的区域。B.抗体的特异性区域可以通过亲和色谱进行非选择性纯化,在该过程中,配体 (蛋白 A、G、L)是结合在分离介质上的。C. 蛋白A、G、L亦可用于纯化特异性蛋白。这种情况下,抗体作为中间配体为其抗原提供选择性。
基本柱层析设备:
固定相:一种惰性介质, 通常带有一种可促进蛋白质相互作用的官能团以进行蛋白质分离。固定相和官能团的选择取决于层析色谱和方法的种类。
柱子:一种圆柱形玻璃容器,长度和直径各不相同。柱子可以直接购买已填装固定相能直接连接到层析设备上使用的预装柱(参见本章第2部分),或可购买空柱自己手动填装。自动层析设备和人工重力柱使用的是不种类型的柱子。
溶剂:含有添加剂的缓冲液,作为将蛋白质在固定相上平衡和洗脱的流动相。不同类型的柱层析需要不同的溶液条件
收集管:用于收集洗脱液样品的容器。自动组分收集器需要特定的收集管。手动收集时,则试管或容器均可使用。
纯度检测方法:一种检测样品里所有蛋白质中目标蛋白相对含量的检测手段。每一步获得的含有目标蛋白的组分都必须在进行下一步纯化工作前进行检测。后面的章节将对一些常用的纯度分析方法进行讨论。
柱层析系统
柱层析可以依赖用泵将溶剂以固定流速打入填装好的层析柱的自动设备(图2)来完成或者依靠流动相的重力作用自己完成。自动系统或者重力柱系统均可与自动组分收集器连接使用。两者都有各自的优缺点。GE Healthcare的AKTA FPLC system是目前应用最为广泛的系统之一
[5][6][7][8] 。
系统类型优点缺点
自动设备自动运行
常连接一台吸光度检测器
可程序设定平衡和洗脱步骤
可轻松设定梯度洗脱
重复性好
需要配套特定、昂贵的设备
最大流速受层析柱压力限限制
重力流便宜
操作者可控性更强
运行过程中可随时调节
更依赖人工
流速受重力作用限制
表3 蛋白质分离柱层析系统。总结自GE。
柱层析种类
四种主要的柱层析类型包括亲和层析、离子交换层析 (IEX)、疏水层析(HIC)和体积排阻层析 (SEC)。大部分纯化过程需要用到其中一种或者多种层析方法以获得后续应用所需纯度的蛋白质产物。选择最合适的层析方法并排序就是优化蛋白质纯化工艺最关键的内容。
层析种类分离蛋白的作用原理结合部分流动相
亲和特异性作用无竞争配体竞争性配体(特异??);可破坏蛋白质间(非特异性)相互作用力的条件
离子交换表面电荷低离子强度高离子强度;增加(阳离子交换)或降低(阴离子交换)pH值
疏水作用疏水性高离子强度低离子强度
尺寸排阻水力学半径
表 4蛋白质纯化中最常用的4种柱层析类型。
通过对蛋白质序列进行分析,可以鉴定出其特有的性质以选择相应的纯化过程。在测定蛋白质疏水残基伸展程度的同时,亦可测定其分子尺寸和(某特定pH值时的)电荷情况。
亲和层析
亲和层析主要依靠蛋白质与介质配体间特异性的可逆结合作用进行分离。配体可直接与目标蛋白质结合,也可以与蛋白质共价结合的标签结合。亲和层析通常是一种最粗放的纯化过程,一般在纯化工艺的前期应用。基于后续应用的要求,可能只需要一步亲和层析即可获得纯度合格的蛋白质。
图 5. 蛋白质净电荷受其溶剂pH值影响。当pH=pI时,蛋白质净电荷为0,因此既不与阴离子交换的固定相也不与阳离子交换的固定相相结合。调节pH值高于或低于pI值可使蛋白质带上净电荷,使其与阴离子交换树脂(pH > pI)的固定相或者阳离子交换(pH < pI)的固定相相结合。
亲和层析的固定相是一种共价结合特异性配体的惰性介质,该配体可与一个蛋白质或一类蛋白质特异性结合。惰性介质通常是交联的琼脂糖或者聚丙烯酰胺。蛋白质可采用选择性或非选择性模式来进行亲和柱层析纯化。在选择性亲和柱层析中,一般使用对蛋白质有特异性作用的配体或共价结合的标签。在非选择性亲和柱层析中,如用于免疫球蛋白纯化的蛋白A、G、L,用于DNA结合蛋白的肝素或用于糖蛋白的凝集素等,这些配体与一类蛋白都具有相似的结合能力。
两类亲和色谱中,在不影响蛋白质(或标签) 和配体间作用力的条件下,蛋白质均在柱上保留。在不破坏特异性相互作用但可破坏所有杂蛋白与固定相间其非特异性作用的条件下,对所有结合的蛋白质进行淋洗。最后用含有竞争分子的缓冲液或者可破坏所有蛋白质间相互作用的条件对结合蛋白进行洗脱。竞争分子可代替目标蛋白与配体相结合。这种竞争分子可通过其他层析手段或者透析的方式从目标蛋白中去除。通过破坏所有蛋白间相互作用来从固定相洗脱蛋白的方法包括调节缓冲液的pH值或者离子强度。因为这些方法同样会影响蛋白质的稳定性,因此通常建议洗脱下来的蛋白质要立即中和或者稀释以将危害降到最小。有报道称,对于不同形式的亲和层析,为获得最高产率的活性蛋白需采用多种不同的流动相条件
[9][10] 。
目标蛋白配体伴随洗脱
抗体(抗原特异性)抗原多肽自由肽
多组氨酸标记蛋白Ni2+ or Co2+咪唑或游离组氨酸
FLAG标记蛋白质FLAG特异性抗体FLAG多肽或低pH值
GST标记蛋白质还原型谷胱甘肽游离谷胱甘肽
Myc标记蛋白质Myc特异性抗体低pH值
抗体(类型特异性)蛋白A , G, or L极端pH值
DNA结合蛋白质肝素高离子强度
表 5带有特异性活性官能团(配体)的选择性和非选择性亲和层析示例及其典型洗脱条件。总结自Thermo Fisher Pierce和GE。不同类型层析柱的供应商见下,由来邦网(Labome)基于200余篇文献调研给出。
设计蛋白质表达质粒时,即可在其N端或C端(或在少数情况下,在结构已知蛋白质的柔性环状区域) 引入亲和标签以助于纯化。请参见来邦网(Labome)关于
protein/protide tags 一系列常用标签及相关讨论的调查。
抗体通常是基于抗体与其抗原 (抗体识别的序列) 间的高特异性相互作用来进行纯化。一个含有抗原的多肽可以与带有抗体特异结合位点的介质相结合。降低流动相缓冲液的pH值可破坏抗体/多肽间相互作用力,释放出结合抗体。商业上,该方法常用于血清原液中抗体的纯??
图 6. 离子交换层析。蛋白质在低离子强度条件下与带电的固定相相结合。结合的蛋白质可以通过增加缓冲液的离子强度或者调节其pH值进行洗脱。
蛋白质同样可通过非选择性方式进行亲和纯化。在非选择性纯化过程中,固定相上结合的配体可以与一类具有类似结合部位的蛋白质相结合。DNA结合蛋白质的纯化就是一个非选择性亲和层析的实例。因为肝素与DNA的结构和电荷极为类似,它可以被作为DNA结合蛋白质亲和层析的配体。由于所有的DNA结合蛋白质理论上都可以与该固定相结合,几乎其他所有蛋白质都会穿透而不与介质结合,从而可达到目标蛋白产率最大程度的富集。另一个例子是抗体通过其恒定区 (Fc)与配体间的相互作用进行富集浓缩,蛋白A、G、L都是常用的配体。GE Healthcare的蛋白A亲和层析柱
[11][12][13] 和蛋白G
[14] 都是常用的选择。
当采用类似的结合模式(抗体与蛋白A、 G或 L配体结合)时,抗体的抗原结合区(Fab)仍然保持与其特异性抗原结合的能力。因此,特异性蛋白可通过配体/抗体结合和抗体的抗原间的特异性相互作用来纯化。
常见问题及解决方式见表6。
问题原因解决方法
蛋白不结合标签未翻译或不可及检查质粒序列或将标签移到其他位置
结合条件不合适调节缓冲液条件
结合时间不够降低流速或停止过柱以延长结合时间
蛋白未洗脱出配体与标签间相互作用过强增大(特异性) 竞争分子浓度或调节条件更严格(非特异性)
蛋白质柱上聚集调整缓冲液到更利于保持蛋白质稳定性的条件
低分辨率流速过慢或过快调整流速
柱子未充分洗脱用条件更严格的缓冲液淋洗;根据厂家指导清洗固定相
蛋白质柱上聚集调整缓冲液到更利于保持蛋白质稳定性的条件
洗脱条件不够严格增大(特异性) 竞争分子浓度,或调节条件(非特异性)
纯化过程中蛋白质失活蛋白质去折叠或聚集调整缓冲液到更利于保持蛋白质稳定性的条件
保持活性必要的辅因子在纯化过程中被除去添加辅因子
表6 亲和层析问题解决方案。总结自GE。
离子交换层析(IEX)
离子交换层析分离蛋白的原理是基于其净电荷的不同,通过蛋白质与带电荷的固定相之间的静电作用力进行分离。IEX有以下两类: (1)阴离子交换层析 (固定相带正电荷,与带负电的蛋白质相结合);(2)阳离子交换层析(固定相带负电,与带正电的蛋白质相结合)。 离子交换层析常用于蛋白质纯化工艺中期。但是,对某些蛋白,在纯化工艺的前期或后期采用该方法亦可获得良好的分离效果。
由于氨基酸的基本结构和与其共价结合的修饰成分的影响,所有的蛋白质都会带有净电荷。由于溶剂可以与蛋白质相互交换氢离子,因此蛋白质的净电荷受其溶剂pH值的影响。蛋白质的等电点(pI)是蛋白质不带电时的pH值。当pH值高于pI时,蛋白质会带负电,而当pH值低于pI时,蛋白质带正电。因此,可以通过调节溶液的pH值来控制结合蛋白是与离子交换柱结合或是从柱上洗脱。
图 7. 疏水作用层析。在高离子强度下,蛋白质部分去溶剂化,使其通常隐藏在内部的疏水部分更多地暴露出来。这些残基会与介质上的疏水官能团发生疏水相互作用。降低离子强度可以使蛋白质重新隐藏其疏水部分,折叠回复原结构。这会降低蛋白质与固定相之间的疏水相互作用,完成蛋白质的洗脱。
理论上来说,只要缓冲液pH值调节合适,所有的蛋白质都可以与阳离子交换柱和阴离子交换柱结合。但是,蛋白质纯化过程中,选择纯化条件和层析柱类型时最重要的考虑因素就是要保持蛋白?实奈榷ㄐ浴R虼耍≡衲囊恢掷胱咏换徊阄龊脱≡袷裁囱奶跫嵊跋斓鞍字饰榷ㄐ院突钚允潜匦胍剂康摹Mǔ#恍┯肽忱嗬胱咏换徊阄鱿嘟岷系奶跫赡芏阅持值鞍字时榷云渌鞍字矢鲜省?
了解蛋白质等电点的知识可帮助寻找最合适的离子交换层析方法。以下在线工具可计算一个蛋白质的理论等电点
EXPASY。 这些计算都完全基于蛋白质的氨基酸序列,不考虑其三维空间结构。而在实际情况中,一个蛋白质的某些残基可能暴露得比其他部分更多,所以,其实际pI和表面净电荷某些时候可能与理论计算值不尽相符
[15] 。氨基酸的相对位置分布同样会影响一个蛋白质的pI值
[16] ,而这一点在理论计算时同样未予考虑。有些技术可通过实验方法测得蛋白质实际的pI值,如等电聚焦电泳
[17] 、等电聚焦毛细管电泳
[18] 和高通量光学测量法等
[19] 。
蛋白质与IEX的结合必须采用较宽pH值范围的溶液进行多次尝试以获得最合适的蛋白质保留pH值。在pI值左右1个pH单位的溶液pH值通常认为是较合适的蛋白质结合pH值
[20] 。但是,在有些情况下,也可能需要在远离pI值的pH值条件下进行
[21] 。
IEX的固定相是由惰性琼脂糖或者高分子基质与带电基团共价结合组成。介质微粒有很多尺寸,可以无孔,也可以有多种不同尺寸的孔。介质的选择主要根据所需的结合能力、分辨率和流速要求来决定。介质颗粒尺寸越小,分辨率越高,但相应的流速也越低,分离时间也更长。多孔介质比无孔介质的结合能力更强。无孔介质中,蛋白质不能进入树脂内部,因此相比多孔介质,前者的样品回收率更高,分辨率更高,分离时间也更短。一个研究表明,对于大多数蛋白质,采用无孔介质和多孔介质的分辨率和回收率都类似,但对于尺寸较大的蛋白质,多孔介质由于体积排阻效应而在分辨率上有一定损失
[22] 。
图 8. 逐渐降低盐(硫酸铵)浓度梯度从疏水柱上洗脱下的蛋白质。收集的组分需进行蛋白浓度和目标蛋白特异性活性的检测。根据蛋白质活性检测结果,目标蛋白的浓度在第45组组分中达到最高。源自 http://www.insectscience.org/9.04/。
IEX中最常用的4种带电官能团如下所示。它们根据离子交换能力的强弱分类,强离子交换基团可离子化的pH范围比弱离子交换基团的范围更大。
阴离子交换 (固定相带正电):
季铵(Q) - 强阴离子交换基团
二乙氨乙基(DEAE) -弱阴离子交换基团
阳离子交换 (固定相带负电):
磺酸甲酯(S) -强阳离子交换基团
羧甲基(CM) - 弱阳离子交换基团
因为强离子交换基团的活性基团在很大的pH范围内均可保持带电,它可以在蛋白质结合所需pH值是特别强的酸性或碱性的情况下使用(假设该pH值下蛋白质稳定性仍得以保持),
[23] 。有些蛋白质在弱离子交换上的保留较弱,使得它们可以用较低的离子强度洗脱
[24] 。由于高离子强度会影响部分蛋白质的稳定性
[25] ,而弱离子交换不需要在极端的pH值条件下进行蛋白质的结合,因此可能对蛋白质更合适。
离子交换色谱的固定相首先用低离子强度的缓冲液平衡,然后将蛋白质样品用和平衡过程相同离子强度的缓冲液上样到固定相。结合的蛋白质在用更高离子强度或pH值不同(图6)的缓冲液洗脱前先淋洗一段时间。洗脱缓冲液中的抗衡离子与带电的固定相相互作用,取代了柱上的蛋白质。在离子交换层析中,某些盐类代替结合蛋白和保持蛋白质稳定性的能力,可能比其他种类的盐可能更有效
[26] 。NaCl或KCl是洗脱液中最常用的盐类,其中Na+或K+是阳离子交换层析中的抗衡离子,Cl-是阴离子交换层析中的抗衡离子。另一方面,还可以通过调节缓冲液的pH值来减少蛋白质的电荷并破坏其与固定相之间的相互作用。对于结合到阳离子交换固定相上的蛋白质,增加缓冲液pH值会使蛋白质所带正电荷减少,因此可将其从柱上洗脱下来。对于结合到阴离子交换固定相上的蛋白质,降低pH值可减少蛋白质所带负电荷将其从柱上洗脱下来。
图 9. 三种不同水力学半径的蛋白质混合物用体积排阻色谱柱分离。大蛋白因为不能进入介质孔道内部而只能直接流经柱体最先流出。稍小的蛋白质会进入介质孔道内部,流经的路径更复杂,因此需要更多的时间来穿过介质并流出柱体
同时,还可以调节缓冲液的pH值使目标蛋白质不与离子交换固定相相结合,而与此同时杂蛋白与固定相结合。如此,可在穿透液中收集目标蛋白质,而杂蛋白通过与固定相结合得以去除。
与其他层析方法相比,离子交换层析在确定蛋白质结合、洗脱和获得足够高的分辨率的最佳条件时可能需要解决更多的问题。
问题原因解决方法
蛋白质未结合层析柱未平衡运行更多的平衡缓冲液,蛋白质再次上样
结合缓冲液的离子强度过高缓冲液离子强度过低
pH偏离pI不够远调节缓冲液pH值 (阳离子交换的调低,阴离子交换的调高)
蛋白质未洗脱洗脱缓冲液的离子强度过低增加离子强度
蛋白质柱上聚集调整缓冲液到更利于保持蛋白质稳定性的条件
分辨率低流速过快或过慢调节流速
层析柱未淋洗充分用更高离子强度的缓冲液淋洗;根据厂家指导清洗固定相
蛋白质柱上聚集调整缓冲液到更利于保持蛋白质稳定性的条件
蛋白质纯化过程中失活蛋白质去折叠或聚集调整缓冲液到更利于保持蛋白质稳定性的条件
保持活性必要的辅因子在纯化过程中被除去添加辅因子
表 7 离子交换层析的问题解决。总结自GE。
疏水作用层析HIC)
疏水作用层析(HIC)分离蛋白质主要是基于它们疏水性的不同。它常在蛋白质纯化工艺的中期使用。在HIC中,蛋白质在高离子强度的缓冲液中与固定相结合,因此,无需更换缓冲液或者洗脱液即可在离子交换色谱之后直接应用HIC。同样,HIC也可以跟在通过用盐类沉淀快速去除部分而非全部蛋白质的硫酸铵沉淀步骤之后实施。HIC有时在纯化工艺的前期使用,有时也作为最后一个步骤来去除目标蛋白中的微量杂质。
溶液中存在的盐离子可能导致蛋白质的部分去折叠,暴露出部分常规情况下隐藏于内部的疏水残基。当加入离子强度较低的缓冲液时,结合到固定相的蛋白质恢复到原折叠结构。由此,可减少其可与固定相相互作用的疏水残基的暴露,有利于蛋白质从固定相上洗脱下来。 因为蛋白质可以随着离子强度的降低而自动地再折叠回原结构,所以HIC是一种非常有价值的一种蛋白质纯化手段。
离子强度应该尽量低,使其可以促使目标蛋白结合,同时又不会导致蛋白质沉淀。如果结合所需离子强度高到导致目标蛋白的沉淀,可以使用略低的离子强度。这种情况下,层析过程可以将所有结合蛋白质与穿透的未结合目标蛋白分离开。
在层析柱上样前,固定相必须用高离子强度的缓冲盐平衡(蛋白质样品所使用的相同的缓冲液),然后柱上上样,并淋洗一段时间后,再用较低离子强度的缓冲液将蛋白质洗脱(图 7、8)。
疏水作用层析的固定相是由交联的琼脂糖或合成的共聚高分子的骨架组成。骨架上共价连接上烷基或者芳香基的配体,以便与疏水性分子产生特异性相互作用。
官能团的种类包括:
烷基 - 不同长度的碳氢链结构,通常为丁基或者辛基。固定相的结合能力随着烷基链的增长而增加
[27] 。官能团结合蛋白的能力主要是基于蛋白质的疏水性
芳香基 - 一种由芳环衍生而来的官能团,通常为苄基。芳香基的特异性通常更高,因为蛋白质还可以通过基本的堆积作用与该官能团相互作用。
每一种蛋白的结合和洗脱缓冲液所用盐的种类和浓度都应经由实际实验确定。此外,蛋白质的再折叠和活性在洗脱后都必须得到保证。
和其他柱层析类似,优化HIC工艺时也需要解决大量的问题。每一种蛋白都需要调节缓冲液条件和固定相以保证获得最优化的分离。
问题原因解决方法
蛋白质未结合层析柱未平衡柱上运行更多的缓冲液,蛋白质再次上样
结合缓冲液的离子强度过低增加缓冲液离子强度
在所使用的离子强度下蛋白质聚集降低缓冲液离子强度或者换盐
蛋白质未洗脱洗脱缓冲液的离子强度过高降低离子强度
蛋白质柱上聚集调整缓冲液到更利于保持蛋白质稳定性的条件
保留过高尝试保留能力更低的固定相
分辨率低流速过低或过高调整流速
层析柱淋洗不充分用低离子强度的缓冲液淋洗;根据厂家指导清洗固定相
蛋白质柱上聚集调整缓冲液到更利于保持蛋白质稳定性的条件
柱上保留弱尝试保留能力更强的固定相
蛋白质在纯化过程中失活蛋白质去折叠或聚集调整缓冲液到更利于保持蛋白质稳定性的条件
蛋白质未恢复天然状态尝试采用别的盐进行结合或者采取较低的离子强度;包括为保持蛋白质稳定性的添加剂
保持活性必要的辅因子在纯化过程中被除去添加辅因子
表8. 疏水作用层析的问题解决。总结自GE。
体积排阻层析(SEC)
体积排阻层析是根据蛋白质具有不同的水力学半径将它们进行分离,该数据主要通过测量分子尺寸和形状两方面信息获得。与上述其他层析过程不同的是,蛋白质不与SEC的固定相相结合,而是依靠它们通过惰性固定相的速度不同来完成分离。(图9).
基于SEC可分辨不同种类蛋白的能力,它通常是一种用于最后一步纯化的有效方法。 低聚物
[28] 、去折叠的蛋白分子
[29] 和缺失蛋白
[30] 都可以在逐渐置换缓冲液的过程中与结构完整的天然蛋白质分子分离开。通常,由于SEC可使用溶剂种类更多,所用的缓冲盐也更少,因此比透析的缓冲液置换过程更快也更可靠。整个SEC过程都只使用一种溶剂,而市购的SEC固定相几乎与所有常规的缓冲液兼容。
固定相的类型和柱子的长度对蛋白质的SEC分离的分辨率有很大的影响。市场上有很多种固定相可选,其选择最好是根据待分离蛋白质分子的分子量和分离条件两方面来决定。
固定相介质特点
Sephadex葡聚糖和环氧氯丙烷交联物可提供快速的缓冲液交换和组分离
适用于分子量分析
可高压灭菌
介质在某些溶剂中会收缩
部分类型的sephadex可在有机溶剂中使用
Sephacryl烯丙基葡聚糖和N,N-亚甲基双丙烯酰胺交联物可分离分子量范围宽
可高压灭菌
可在水相和有机相使用
高回收率
Sepharose交联琼脂糖可分离分子量范围宽
高回收率
不可高压灭菌
Superose高交联琼脂糖可在水相和有机相使用
可高压灭菌
蛋白质与介质间可有强疏水作用
可使用粘度较大的溶剂
Superdex琼脂糖-葡聚糖交联物可在水相和有机相使用
可高压灭菌
分辨率高
回收率高
Table 9. 市售体积排阻层析用固定相种类及特点。总结自GE和Simga-Aldrich。
由于Superdex能与几乎所有溶剂相容,且在所有固定相中它的分辨率最高,因此它在典型的SEC过程中通常是最好的选择。
与其他层析方法一样,SEC同样既有优点也有缺点。是否采用SEC要取决于蛋白质本身及其后续应用的要求。
SEC的优点:
可进行缓冲液交换和脱盐。
可分离其他纯化技术难以分离的相似品种(如蛋白片段和低聚物)。
可与多种溶剂相容。
不依赖于蛋白质的任何一种特殊形式进行保留和洗脱。
SEC的缺点:
分离效果严重依赖柱子的填装效果。
蛋白质与介质间有非特异性相互作用,会降低分辨?省?
对复杂的蛋白质混合物分辨率低。
为保证足够的分辨率,上样量必须较小。这对沉淀得到的高浓度蛋白质是一个问题。
要优化SEC条件以获得最好的分离效果,常常需要耗费大量时间,而一些因素会对分离效果产生非常大的影响。
提高SEC分离效果的条件:
上样体积尽量最小。上样体积越小,洗脱组分的扩散将会越弱。
缓冲液中加盐。少量的盐有助于防止蛋白质与固定相间的非特异性相互作用。这将保证所有的蛋白质可以稳定地流过整个层析柱。
采用合适的流速。流速过快使得小分子没有足够的时间流经介质孔道,流速过慢则会导致样品扩散时间增加。
保证样品和溶剂的黏度接近。调整样品的条件使其与洗脱缓冲液的类似。
调整层析柱长度。柱子过短使蛋白质分离不充分。而柱子过长则使得蛋白质样品扩散严重。
重装柱子。柱子的填装效果会蛋白质的分离效果有相当大的影响。
如果介质颗粒没有分布均匀或者填装时带入气泡,蛋白质将不能顺利地流过固定相。此外,如果柱子跑干了,就必须重装。柱子填装不好通常就是分离效果不好的原因。
由于SEC并不是基于蛋白质官能团间的相互作用来进行分离,所有的蛋白质都在相同的条件下进行洗脱,所以分离效果仅仅依赖于蛋白质各自不同的水力学半径。因此,SEC通常不适合在含有较多杂蛋白的纯化工艺前期使用。但是,SEC又可作为一种快速可靠的样品脱盐或者小分子去除方法用于分离工艺前或中期。在纯化的最后阶段,当只剩痕量杂蛋白时,SEC则是一种蛋白质分离和置换保存缓冲液的有效方法。
蛋白质洗脱方法
固定相上结合的蛋白质要用可破坏结合作用力的溶剂条件进行洗脱。这些流动相的条件要根据层析类型和目标蛋白质的性质来选择。蛋白质洗脱方法通常包括以下三种:批次洗脱,阶梯式洗脱和线性梯度洗脱。如何选择最好的方法要依靠采用的层析方式和所需的分离效果来决定。
批次洗脱 - 一步即将所有结合蛋白质一次性洗脱。基于特异性相互作用 (如亲层析)的层析方法最好采用这种方式。批次洗脱法没有任何分离效果,但它可以很好地快速去除杂质。它需要事先了解取代目标蛋白所需的缓冲液条件。
阶梯式洗脱 - 连续进行多步批次洗脱,并每次逐渐增强洗脱条件。在阶梯式洗脱中,收集的组分数取决于连续批次洗脱的次数。阶梯式洗脱比批次洗脱的分离效果要好,但比线性梯度洗脱的效果要差。
线性梯度洗脱 - 当流动相以线性梯度洗脱时可收集多种连续流出的组分。对于离子交换层析和疏水作用层析,线性梯度洗脱可以获得最好的分离效果,同时,它还可以收集到大量的连续组分。
由于体积排阻层析中蛋白质和固定相之间不存在相互作用,因此不需要采用任何一种上述洗脱方法。蛋白质上样后,无需改变洗脱缓冲液的条件,即可连续不断地收集各分离组分至所有蛋白质全部被洗脱为止
理想的情况是这根层析柱所采用的洗脱缓冲液同样可用于后续的层析柱,由此可省去两步之间必须的缓冲液置换或者透析操作。
图 10. 蛋白质纯化工艺中收集的蛋白质样品的SDS-PAGE检测结果。所有的蛋白质经染色均肉眼可视。源自 http://www.omicsonline.org/。
组分纯度分析
每一次柱层析分离完成后,收集的组分必须进行分析以检测其所含的目标蛋白及各组分的相对纯度。每一步之后都需要进行该类分析以确定哪些组分可以被合并用于下一步。为检测纯度,必须有一种方法能检测出某种特定蛋白质相对所有蛋白质的含量。下列即为一些常用于纯度分析的方法:
聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) - 一种基于蛋白质尺寸不同来进行分离的变性凝胶。市售染色剂可使样品中所有蛋白质显色可见,可据此对蛋白质进行纯度分析(图10)。SDS-PAGE不能对组分进行大规模的分析,并且需要耗费数小时。但由于易操作、经济且适用于所有蛋白,因此它仍然是一种最常用采用的方法。
光谱分析 - 一种分析蛋白质光学性质的方法。这种用于蛋白质纯度分析的方法只适用于如细胞色素P450等具有独特光学特征的蛋白质。这一类蛋白质在某特定波长(420 nm附近
[31] )有吸收而其他蛋白质没有,因此比较它在420nm和280nm处 (该波长处所有蛋白质均有吸收) 的吸收,即可获得该蛋白质的纯度信息。这个方法快速且可大规模操作,但仅使用于部分蛋白质。
蛋白质测活 - 一种目标蛋白的酶活实验。这种测定蛋白质纯度的方法通常与其他蛋白质浓度测定方法相结合以计算其相对整体蛋白质浓度的活性。活性测试只适用于活性可以被高通量方法如酶解测活的蛋白质。对某些蛋白质而言,活性测试提供了一种快速可靠的蛋白质检测方法。酶的测活是非常有用的,因为这样在下一步应用前即可先将失活的蛋白质排除出去。
纯化后蛋白的保存
当蛋白质纯度已满足实验研究的要求时,即可将其以合适的方式保存起来。最终保存用缓冲液的选择和纯化过程中选择所用的缓冲液一样重要,同样依赖于蛋白质的稳定性和纯化蛋白质后续应用所需条件来选择。通常,因为在SEC层析过程中可以完成缓冲液的有效置换,因此它通常被安排为整个纯化工艺的最后一步。纯化的组分可以立即合并保存,或者最后合并的组分也可以透析为所选的缓冲液后再保存。
由于蛋白质的保存条件取决于目标蛋白本身,应将其优化至能长期保持蛋白质结构和功能稳定性的条件。在储存条件下,保存缓冲液中通常会加入一些添加剂用于延长纯化蛋白的保存期。由于每种蛋白质的表现各不相同,因此需要通过多次实验来寻找最合适的保存条件
来邦网(Labome)关于引用蛋白质纯化文献的调研
来邦网(Labome)从242篇引用了蛋白质纯化方法的公开文献中随机调研了98篇。表10列出了主要供应商和纯化方法。亲和层析和体积排阻层析是文献中最常用到的方法。GE Healthcare是所有层析方法的主要供应商。Qiagen是用于蛋白质纯化的HIS标签最主要的供应商,而Sigma Aldrich主要提供FLAG标签。
类型供应商主要品牌文献数目参考文献
亲和层析
HISQiagen Ni-NTA agarose26
[32][33][34][35][36][37][38][39][40][41][42][43][44][45][12][46][47][48][49][50][51][7][52][53][54][55]GE Healthcare HisTrap FF/HP 7
[56][57][6][58][59][60][61]GE Healthcare Ni Sepharose 4
[62][63][64][43]Clontech TALON Metal affinity 7
[65][66][67][68][69][70][71][72]GST GE Healthcare glutathione Sepharose 4B 14
[73][74][75][42][68][76][67][77][39][78][51][79][80][57]Sigma-Aldrich glutathione agarose 2
[81][34]FLAG Sigma-Aldrich FLAG M2 affinity11
[82][78][83][59][78][84][82][83][85][59][86]其他引用到的亲和层析蛋白纯化系统包括Vector实验室用于0-linked糖蛋白纯化的琼脂糖基质Jacalin介质
[70] , New England Biolabs用于带麦芽糖标签蛋白纯化的支链淀粉树脂
[34][87][65] ,Roche的 anti-Protein C亲和介质
[59] , Thermo Fisher Pierce
[88][65][89] 、EMD Millipore
[90][91] 和Sigma-Aldrich
[88] 的strepbiotin系统, Sigma-Aldrich Myc 的免疫亲和介质
[82] ,GE Healthcare用于螯合金属离子蛋白质的Chelating Sepharose Fast Flow
[92] 和它的HiTrap IMAC HP 柱
[93] ,GE Life Sciences的heparin 柱
[94][95][92] ,GE Healthcare Life Sciences的HiTrap Protein A
[12] ,GE Healthcare的IgG Sepharose
[96] ,Sigma的V5-agarose
[79] 。
体积排阻层析
Superdex GE-Healthcare31
[97][95][93][98][61][93][43][55][63][99][44][100][12][43][101][56][47][5][36][38][63][47][52][60][7][72][102][100][64][103][62][92] ,Superdex 200,19篇
Superose GE Healthcare 4
[44][50][52][50]Sepharose GE Healthcare 2
[87][38]离子交换层析
阴离子GE Healthcare MonoQ 柱 4
[64][76][104][53]GE Healthcare HiTrap Q 4
[105][37][46][52]GE Healthcare Source 15Q 2
[106][34]Whatman DE52 阴离子交换树脂 1
[94]阳离子GE Healthcare 1
[44]疏水作用层析
GE healthcare phenyl sepharose CL-4B 1
[39]表10来邦网(Labome)关于98篇引用蛋白质纯化系统文献的调研。
在调研的文献中,蛋白质样品通过EMD Millipore BugBuster
[63] 、
[91] 、
[48] 或AVESTIN EmulsiFlex C-3 细胞破碎仪
[53][107] 制备,并通过EMD Millipore Amicon Ultra
[103][82][94][108][70] 或Vivaspin
[63][105][66][103] 浓缩仪浓缩。