Ri质粒对茶树和苦瓜的遗传转化及相关功能成分研究

【摘要】： 发根农杆菌(Agrobactorium rhizogenes，Ar)中Ri质粒(根诱导质粒，root inducing plasmid)的T-DNA转移并整合到植物基因组诱导产生发根(hairy root)。相对于常规细胞培养，发根培养系统具有生长快速，不需外源植物激素、遗传性状稳定以及合成次生代谢物质能力强等特点，是生产次生代谢产物较理想的细胞培养体系。 国内外医药学方面的大量研究证明：茶叶中的儿茶素(特别是酯型儿茶素)和苦瓜中的苦瓜皂甙等次生代谢产物具有明显的保健及药理功能。近年来，利用发根培养体系生物合成植物有效成分已成为植物医药研究热点。由于茶树是多年生富含多酚的木本植物，Ri质粒介导的遗传转化有相当的难度，诱导发根形成的成功率低。因此，目前国内外还没建立较完整稳定的Ri质粒转化茶树及其发根培养生产次生代谢物的技术体系；而利用Ri质粒转化苦瓜产生发根以及利用苦瓜发根培养系统生物合成苦瓜皂甙等功能成分的研究在国内外仍是空白。 本文对发根农杆菌致根活力鉴定方法、儿茶素对发根农杆菌的抑制作用及抗酚菌株的筛选、苦瓜皂甙快速测定方法和Ri质粒高频诱导茶及苦瓜发根形成的影响因素进行了系统研究，并对茶及苦瓜发根中的相关功能成分进行了初步分析探讨。本文的主要研究结果如下： 1．发根农杆菌具有完整质粒和活力菌株(R1601)的Km抗性培养菌落特征为涂板培养菌落应较均匀布满整个平板，而划线培养则在划线处均应有菌落生长。 2．儿茶素(TC80)对发根农杆菌有明显的抑制作用，液体培养时MIC_(90)为25μg／ml；而固体培养时的MIC_(90)为100-200μg／ml，无论是液体还是固体培养，其MBC(最小杀菌浓度)为400μg／ml，这阐明了茶树中富含儿茶素等多酚类是制约农杆菌介导法对茶树进行遗传转化的关键因子。 3．通过抗酚筛选获得的抗酚菌株R1000AP，其抗酚性与原始菌株R1000相比明显提高，其MIC_(90)提高近40倍。抗酚菌株(R1000AP)诱导茶树的发根频率比原非抗酚菌株(R1000)提高46.5％，并达显著差异(P＜0.05)。 4．综合分析茶树发根高频诱导影响因素认为：选用抗酚菌株、以含多酚类较低的原料(如绿茶品种)及器官(根或茎)作外植体、采用对外植体细胞壁造成微创的预处理(如萎凋或适度超声)、菌液浓度为OD600=0.8、浸染时间为30min以及共培养添加适当的激素(如IBA5.0mg／L)和共培养时间控制在2d以内，这样的因素水平即构成了Ri质粒对茶树遗传转化的高频诱导系统。 5．由R1000AP菌株诱导形成的发根含有较丰富的儿茶素，其总量高达15.061mg／g，比福鼎大白茶一芽二叶鲜叶原料中的儿茶素总量12.086mg／g还高出近25％，且有近11％的酯型儿茶素的形成。 6．本文建立的苦瓜中苦瓜总皂甙超声波乙醇浸提快速测定方法仅需样品0.1g，浸提溶剂80％乙醇2ml，浸提时间仅需30min，不需加热，降低能耗，分析测定效率提高十倍以上。测定结果与常规的乙醇加热回流没有显著差异。 7．本文对影响Ri质粒高频诱导苦瓜遗传转化因素进行了较系统研究。5种供试菌株中R1000AP诱导发根的效果最全面，不仅发根早，且发根频率和发根密度都最高；苦瓜品种间的遗传转化率没有显著差异(P＞0.05)；茎段比子叶外植体平均高26.3％，这种差异达极显著水平(P＜0.01)；较嫩的苦瓜苗(苗龄10-20d)对发根农杆菌较敏感，有利于遗传转化，而苗龄超过40d苦瓜转化率几乎为零。共培养的适宜时间为1-d时，超过2d的处理，因农杆菌在诱导培养过程中过度生长，而使遗传转化效果下降。共培养基中添加AS对苦瓜的遗传转化没有明显的效果(P＞0.05)。植物激素处理均可使发根形成时间提前5d，并最终提高发根诱导频率，其中IBM5.0诱导苦瓜遗传转化的效果最好。 8．不同外植体诱导形成的发根的形态特征有一定的差异，茎段发根粗短绒毛多，长度多在10-25mm，发根密度为9.0；而子叶发根较粗长，绒毛较少，根长度多在40-50mm，发根密度为11.25。茎段发根的生长速度约为2-5mm／d，而子叶发根的生长速度约为8-10mm／d。 9．用超声醇提—香草醛显色法对试管苗的根、茎、子叶和发根中苦瓜总皂甙进行了比较分析结果表明：发根中苦瓜总皂甙含量最高，分别比苦瓜试管苗的根、茎和子叶含量高68.9％、53.6％和54.7％，且这种差异达到了极显著水平(P＜0.001)。 以上研究结果为Ri质粒介导的茶及苦瓜发根高频诱导与遗传转化系统的建立以及利用该发根培养系统生物合成儿茶素和苦瓜皂甙等功能成分提供了重要科学依据和方法。