不同针刺捻转对结缔组织成纤维细胞的影响

文章来源：Langevin H M, Bouffard N A, Churchill D L, et al. Connective tissue fibroblast response to acupuncture: dose-dependent effect of bidirectional needle rotation[J]. J Altern Complement Med. 2007, 13(3): 355-360.

译者：田亚丽

 

摘要

背景：虽然在针灸疗效中，针刺操作是一个重要的组成部分，但是到目前为止没有证据表明，在人体上实施不同的手法操作会产生不同的针刺疗效。在针刺操作中，捻转是最普遍的操作手法，并且在临床实践中也被广泛应用。

目的：在这个研究中，我们假设双向捻转引起结缔组织中成纤维细胞骨架的重塑，细胞骨架重塑和以前研究中证明的单向捻转引起的细胞骨架重塑是相似的。

干预：18个大鼠的皮下组织标本被随机的分配到不同的捻转针刺组中，在体外捻转30分钟，捻转幅度是180°-270°，随后固定组织标本，共聚焦显微镜成像，并且测量成纤维细胞体的横截面面积。

结果：正如在单向捻转中一样，双向捻转中成纤维细胞发生广泛的细胞扩散，并且形成板状伪足。双向捻转对成纤维细胞的横截面面积（方差分析，P＜0.001）有明显的影响作用。双向捻转对细胞的反应不是单一因素，细胞对捻转的最大反应发生在特定的刺激时间段内，最大反应与捻转幅度和捻转圈数有关。

结论：这项研究表明针刺操作中的细微差别可能引起大鼠皮下结缔组织的细胞反应。需要做进一步的研究证明是否结缔组织反应与治疗效果有关系。

 

 

引言

在临床上，针灸是被广泛使用的治疗方法和技术。在一些情况下，针灸针仅仅扎到穴位，并且在组织留针一段时间，然后出针。在其他的情况下，针灸针扎到穴位后要实施一些操作手法，通常把提插和捻转手法结合起来。最普遍的针刺捻转手法是双向捻转，根据临床情况使用不同的捻转速度和捻转幅度。事实上，针灸师技能的重要部分是选择合适的操作手法，并且根据病人的临床表现应用合适的针刺剂量。

目前没有针刺操作剂量相关效应的研究，主要因为在对照组中使用可重复的针刺手法操作是困难的。在以前的研究中，我们已经在人体和动物身上开始使用自动的针刺方法解决这个问题。在大鼠的皮下组织层中可以观察到，捻转针时胶原蛋白缠绕在针上。在捻转几分钟后，胶原蛋白对针的拉力引起结缔组织中成纤维细胞活跃的细胞反应，这个细胞反应一直扩散到离针以外的几厘米。这种细胞反应包括一个活跃的细胞骨架重组，涉及细胞扩散，细胞扩散是可以测量的，它是作为增加平均成纤维细胞体横截面积。这种效果需要肌动蛋白的收缩，Rho和Rac一样，这两种信号分子涉及到细胞骨架的调制。从培养细胞的模型中获得的大量证据表明，细胞形态和细胞骨架的重塑是力传导反应中的重要组成部分，力传导连接着细胞力学环境中的基本反应，比如基因转录、细胞外基质的生成、细胞粘附动力学。在针刺操作中对成纤维细胞的机械性的刺激可能对结缔组织有重要的、广泛的和长期的作用。

在我们以前的试验中，使用单向针旋转产生的细胞扩散效应，类似于单轴拉伸组织产生的效应。但是更大量的捻转，引起较小的细胞扩散。这非单调的反应模式让人联想到先前描述的在骨中机械性刺激的影响，其中最大的反应发生在特定的 “刺激”窗口。本研究的目的是去检测双向捻转是否和单向捻转一样，对结缔组织层中的成纤维细胞有重塑的能力。这将有重要的临床意义，因为双向捻转在针灸实践中会被更普遍的应用。在大鼠体外，我们已经使用自动的针刺操作研究不同量的捻转对大鼠皮下结缔组织层中的成纤维细胞的形态学的影响。我们假设在针刺操作30分钟之后，针刺捻转的幅度和捻转的圈数对成纤维细胞的横截面面积有影响作用。

 

材料和方法

佛蒙特大学（the University of Vermont）批准委员会通过了本试验提案。18个大鼠被随机的分配到不同的针刺捻转圈数组和不同的捻转幅度组中。3个大鼠分配到不同的条件下。图表1总结了捻转的条件。总的顺时针旋转度数是捻转幅度乘以捻转圈数。每一个旋转周期中包含的等量的顺时针和逆时针旋转。这些旋转变量被选择代表旋转条件与针灸实践相一致。在不同的条件下进行了本研究：（1）不同的旋转周期数；（2）捻转幅度。

杀死大鼠之后，从每只大鼠的背部切取8×3cm的组织瓣，这个组织瓣包括大鼠的真皮、皮下肌肉和皮下组织。组织瓣横向的固定在夹具上，并且浸泡在含有生理盐水的培养液中，培养液的pH7.4、温度为37°C。培养液中含有NaCl:141.8mM、KCL4.7mM、MgSO41.7mM、EDTA0.39mM、CaCl2 2.8mM、HEPES 10 KH2PO4 1.2mM和葡萄糖5.0mM。组织瓣垂直的放置在固定器上，并且近端的夹具上连接到一个500g的能量负载细胞上。组织固定在一对稳定的金属条上，近端和远端夹具之间的距离是保持不变的。把组织和夹具分开，并且把组织从培养液中取除，最后把组织放在解剖显微镜下。针灸针刺到皮下组织的中间并且与真皮是平行的。在扎针的过程中极其谨慎，对组织没有牵拉。然后把组织和夹具放回到37°C的培养液中。针刺器械发动机和针柄连接到针上，并将针刺器械放在钳位上，在旋转过程中以保持在固定的垂直位置。针灸器械被放置在一个螺丝钳上，保证在捻转时针与组织之间是垂直的。

针是以不同的圈数捻转，并且其捻转速度是恒定的（1转/秒）。捻转之后，把发动机从针上取下来，并且把组织培养在37°C的培养液中30分钟。组织浸泡在95%的乙醇中一小时，之后把针从组织中取出，最后把组织在4°C的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中冲洗一晚。

 

组织化学染色

德克萨斯红标记的鬼笔环肽(Texas Red-conjugated phalloidin)是用激光共聚焦显微镜来观察皮下组织成纤维细胞。在磷酸盐缓冲盐水中冲洗一晚后，从组织瓣上切去大小为10×10mm的三个皮下组织样本。组织样本放在载玻片上。幻灯片在4°C 的环境下用德克萨斯红标记的鬼笔环肽染色40分钟，然后用SYTOX绿色核酸染色 或4，6-二脒基-2-苯基吲哚在稀释1:1000的核酸染色5分钟。这个样本用盖玻片覆盖，50%甘油PBS 和1% 酸丙酯作为载体介质。

 

激光共聚焦扫描显微镜与形态分析

用Bio-Rad MRC 1024激光共聚焦显微镜对组织化学染色皮下组织样品进行成像，使用60×油浸物镜（NA 1.4）和568 nm激光激发和2.7的光圈。每个样本分为三个大致相等大小的部分。在每个动物身上有9个标本被成像。组织上的针的轨迹不总是能观察到的（特别是没有捻转或捻转小时），成像的位置在每个部分的中心，不考虑针的位置。

对每一部分，在1um的图像区间获得20张图像。图像导入分析软件包进行形态学分析。所有的细胞集中在10倍光学切面下测量。如果细胞的边界在成像的外面，则这个细胞被排除。细胞未被界定为成纤维细胞或非成纤维细胞。相反，所有的细胞被测量，只是假设在组织中成纤维细胞占主导地位。对于每一个细胞，构造细胞体的边界。细胞体周长被定义为细胞质在平面上的投影轮廓不包括细胞突。细胞突定义为细胞质的延伸部分，其长度大于2um，宽度小于2um。细胞体周长投影到平面上的面积计算为细胞体横截面面积。

 

统计学方法

用方差分析比较在治疗之后平均细胞体的横截面面积。α =0.05是有统计学意义的。使用SAS软件进行统计学分析。

 

结果

双向捻转对成纤维细胞横截面面积的变化有显著的效果。成纤维细胞对捻转幅度和捻转圈数的变化都有反应。当捻转幅度恒定（180°）、捻转圈数发生变化时，捻转到5760时成纤维细胞的横截面面积达到最大。相反，当捻转圈数恒定、捻转幅度从180°到720°时，捻转到2880时成纤维细胞的横截面面积达到最大。因此，当捻转幅度增加时，捻转幅度和捻转圈数相比较，较小的捻转度数也可以引起细胞扩散。增加的捻转幅度与捻转圈数想比较，增加的捻转幅度引起较小的反应。当增加的捻转幅度超过最大值时，细胞变得更小。相反，捻转圈数增加的超过最大值时，细胞一直保持其大小。有趣的是，捻转的总度数是5760时会出现最大和最小的细胞，这取决于实施的捻转方式。

 

讨论

针双向旋转的峰值响应（捻转幅度是360°、捻转圈数为8；捻转幅度是180°、捻转圈数为32）产生的成纤维细胞形态类似于那些以前单向针捻转和简单的组织拉伸，即，大平面与片状伪足延伸在多个方向的平面而没有明显的细胞组织应力纤维（图表3B、C）。相比之下，成纤维细胞暴露于较少的针刺捻转环境时（捻转幅度是180°、捻转圈数为8），成纤维细胞具有更紧密的肌动蛋白细胞骨架结构和更小的细胞体（图表3A）。结合我们以前的研究，这些结果表明，无论是单向还是双向捻转在大鼠皮下组织成纤维细胞中可诱导活性细胞骨架反应。在单向和双向捻转中另一个相同点是显著的非单调细胞反应。总之，最大的细胞反应并不是简单的增加针刺捻转，而是捻转幅度和捻转圈数的特定结合。

我们以前提出的针刺操作对模型的影响主要是对结缔组织中成分的影响，在扎针之后，并且捻转针，结缔组织缠绕在针上。在轻微捻转针之后，结缔组织变紧，并且有效的“锁住”针。进一步的捻转导致大量结缔组织螺旋的缠绕在针上，推测给组织可能会提供一个强大的机械性刺激。这个模型直接从概念上来讲，针的捻转方向是向一个方向时即单向捻转。针先向一个方向小范围的捻转，然后向相反方向捻转相同的范围，在这个双向捻转中不清楚发生了什么。一个简单的模型可能表明，没有网络效应也可以实现，因为相等的缠绕和未缠绕都发生了。然而，以前的试验证据表明，即使向相反方向捻转相同的范围，缠绕是不完全逆转的。在人体上重复的双向缠绕/解除在每个周期中实现了峰值扭矩的增加。以前双向捻转的研究主要集中在机械结果的测量。这项研究的结果进一步支持这个机制，虽然它不能控制在成纤维细胞活性反应的时间段内，但是成纤维细胞的活性细胞反应可能是周期性组织拉伸（无扭转力矩）的结果，而不是组织的缠绕。因为在本研究中，我们目前的针刺系统没有条件测量扭矩范围，进一步的实验，使用敏感的扭矩传感器和比较双向捻转和周期性的组织拉伸来解决这个问题。

不管成纤维细胞扩散是由扭矩积累造成的还是周期性组织拉伸造成的，这项研究的结果表明，在针刺操作中的细微差别可以影响结缔组织层的细胞反应。然而，重要的是去强调，在这个时候，结缔组织对针刺的反应和患者对针刺的反应没有已知的联系。导致治疗效果的可能机制包括基质组成，生物力学特性的变化导致感觉传入到结缔组织。进一步的研究需要去证实在体内和体外针刺潜在的反应。

 

结论

    在大鼠体内皮下组织层中，我们得出结论，双向捻转产生了活跃的细胞骨架反应，这个细胞反应与捻转幅度和捻转圈数有关联。今后的工作将探讨结缔组织反应和其他生理系统（例如，神经系统）的关系，以及结缔组织反应与疗效的关系。