笔者的话：
平时工作中，常常遇到医生提问：“不同品牌肉毒毒素到底有什么差别？”
记得多年前拜访胡兴越主任的时候也聊起过这个话题，胡主任当时一脸诧异地看着我说，“因为他们本来就是不同的啊…”
那么为什么整形美容领域的医生与消费者十分关注的问题，在治疗领域的专家面前，却根本不是问题。时下很多人都在关注肉毒毒素差异化，因此我们趁着长假来好好聊一下这个话题。
抱着“刨根问底，尊重客观事实”的态度，我一个菜鸟级别的旁观者，阅读了大量的文献，采访了将近20个国内外著名“毒咖”，总算对这个问题有了一些眉目。
现在我来谈下我个人的看法，如果有不妥之处，欢迎交流！
肉毒毒素差异化
如何来理解肉毒毒素的单位“U”？
传统的药品，使用的计量单位就是可以看的见的，要么重量，要么体积。而肉毒毒素的本质，是“生物制剂”，生物制剂的计量单位是“生物活性效价单位”。
通俗一点来理解，我们评价某瓶肉毒毒素，不是看它有多重，或者有多大块，而是看它有多少“生物活性”。因此，我们可以这样理解：
肉毒毒素规格成品 = 制药的活性成份（API）+ 赋形剂
而“生物活性效价单位”，并不是一个国际统一的标准，Unfortunately，每个厂家是可以自己来定这个“生物活性效价单位”的。
衡力和保妥适的检测方法都是把制备肉毒毒素的成品重新溶解和稀释后，用LD50方法（小鼠腹腔注射半数致死量）法来测效价。简单来说是指引起一群受试对象50%个体死亡所需的剂量。精确的定义指统计学上获得的，预计引起动物半数死亡的单一剂量。
看似都是一样的方法。但是请注意，这里面，有三条是关键：
1. 稀释剂（这里指的不是复溶所用溶液而是测定LD50时所用稀释液）：
保妥适用的是氯化钠生理盐水；
衡力在2015中国药典里用的是氯化钠生理盐水；
Xeomin使用人血白蛋白作为其未公开稀释剂的稳定剂， 该稳定剂的作用已被证明可以在临床前试验中提高低浓度肉毒毒素的活性。
Dysport用的是明胶磷酸盐缓冲液。
2.检测法的终点（即观察小鼠反应的准确时间，保妥适用的是72小时，Dysport用的是96小时，《2015中国药典》上查到的衡力观察时间是96小时）
附上各项证据，供大家参考：
3.小鼠品系（这帮老鼠的品系，性别，年龄、饮食、温度、季节、饲养环境、老鼠的心情等等blablabla，药典上查到的信息显示，衡力用的老鼠是26-30日龄的SPF级昆明小鼠）
So，不仅是肉毒毒素的化学名都不一样，连他们用的检测方法都不一样。“Allergan LD50 for BOTOX, the Merz LD50 assay for Xeomin , and Speywood LD50 assay for Dysport.”——《Botulinum Toxin for Asian》，并且每一种检测方法都申请了专利。
曾经有两个比较著名的实验，从中不仅可以用于佐证以上结论，还可以看见毒素巨头制药企业良好竞争的风度——拿数据说话：
话说严谨闻名的德国人研发了不带保护蛋白的肉毒毒素Xeomin，于是有了实验室PK（为什么是实验室PK我会在后面详细解释），也是严谨得很，妥妥的处女座风格……。Terrence Hunt在2009年，使用Allergan的检测体系来检测3个不同生产批次的Xeomin的效力，100U≠100U！结果得出，保妥适效力比Xeomin更高，100U的Xeomin才相当于65-75U的保妥适。
这个实验结果一出，对Xeomin的打击无疑是大的。直到2012年，德国毒霸Dressler Dirk（点击观看Dressler Dirk在第二届中国肉毒毒素论坛接受采访）发表了另外一篇文章，文中用了Merz公司的检测方法测量5个不同批次的保妥适和Xeomin的效价，得出的结论是，两个产品的效价是相当的。保妥适平均103.1U，Xeomin平均101.7U。这才扳回一局。
因此我们现在可以理解了，原来不同的检测体系来测不同品牌的肉毒毒素，得出的效力结论是不同的。上述数据还很清楚地显示了，即便是同一个品牌的肉毒毒素，不同批次的效力也是不尽相同的。
那么衡力呢？中国医生使用衡力20年了，即便Allergan中国一直在强调，有著名的DAS实验显示保妥适的效力是高于衡力的，为什么中国医生还是觉得，衡力的力道更大？
以上疑问我们会在以后的文章中一一为大家详解！
国产肉毒毒素“衡力”的分子量，是单一稳定的。有实验数据显示为1100KD，而非300、500、900KD的混合物。
目前全球在售肉毒毒素品牌中，除了Xeomin外，其余所有品牌的肉毒毒素都是以“蛋白复合物”的形式存在。下图想必所有毒医们都很熟悉，即保妥适的分子图，其中外部保护蓝色的保护蛋白为750KD分子量的辅助蛋白，150KD的神经毒素分子在里面。
在毒素分子外面包裹的辅助蛋白扮演了什么样的角色呢？
有医生告诉我，那是因为辅助蛋白可能具有稳定和保护核心毒素的作用，不同体积的辅助蛋白对核心毒素的稳定和保护作用可能不同，辅助蛋白体积越大、对核心毒素的保护作用可能越好，并且，肉毒毒素分子量的变化，可能会影响蛋白分子在组织内的移动速度。
需要明确的是，辅助蛋白其实不是必须存在的，比方说Xeomin。在这里，我们来探讨一下辅助蛋白的作用。事实上之所以写本文，也是想对肉毒毒素的基础知识做一个系统化的梳理，回顾以往的知识。
以下观点引自Botulinum toxin type A products are not interchangeable: a review ofthe evidence一文。
“临床前证据表明，辅助蛋白可能是神经毒素的物理保护，使免疫系统无法“看见”毒素部分，不能形成中和抗体。”
笔者查阅了原文，以上这个结论原文是支持的，请大家仔细阅读：
Preclinical evidence suggests that theNAPs may physically protect the neurotoxin so that the immunesystem doesn’t “see” the portion of the toxin that would engender formation ofneutralizing antibodies – antibodies that may interfere withclinical response.
但是对于“不同体积的辅助蛋白对核心毒素的稳定和保护作用可能不同，辅助蛋白体积越大、对核心毒素的保护作用可能越好，并且，肉毒毒素分子量的变化，可能会影响蛋白分子在组织内的移动速度。”这个观点，并未在原文中体现。
笔者试图查阅关于“辅助蛋白如何对核心毒素的保护作用”的文献，却查到了以下文献：
2010年，Jürgen Frevert和Dirk Dressler一起发表了Complexingproteins in botulinum toxin type A drugs: a help or a hindrance? 此文中提出了以下观点：A型肉毒杆菌毒素是含有活性神经毒素和辅助蛋白的高分子量蛋白质复合物，后者被认为在胃肠道中保护神经毒素，并可促进其吸收。通过对比常规的A型肉毒毒素（含辅助蛋白）与Xeomin，强烈提示辅助蛋白不影响活性神经毒素的扩散。Xeomin的研究也表明，辅助蛋白不能提高储存中的产品稳定性……对A型毒素毒素的稳定性没有贡献，并且对其治疗效果没有贡献……
面对截然不同的两方观点，笔者请教了一些肉毒毒素基础研究的大咖们之后，终于明白了，原来当肉毒毒素作口服治疗药物的时候，辅助蛋白会保护本身脆弱的150KD的毒素分子抵抗胃肠道的恶劣环境（胃肠道环境的PH值为酸性，游离的150KD的毒素分子不容易被吸收），并帮助150KD的毒素分子在释放到一般循环中之前，通过肠上皮屏障，从而保护和提高肉毒毒素的稳定性，但是目前，对辅助蛋白在肉毒毒素中的作用机制是尚不清楚的。希望我们可以在今后慢慢研究辅助蛋白的作用，一句话，来日方长~
此外，关于“肉毒毒素分子量的变化，可能会影响蛋白分子在组织内的移动速度”这个观点，我们在最后来讨论。
说到这里，笔者好奇心起，有没有其他分子量的肉毒毒素呢？答案是有的，因为辅助蛋白有150kD-900KD，所以肉毒毒素的分子量也是不止300、500、900这三种的。
保妥适的工艺之一就是“纯化”，即提取了单一的900KD的毒素蛋白复合物（参考上图）。以下是保妥适的高效液相色谱法测肉毒毒素分子量的实验。笔者仔细阅读了原文，原文的结论如下：神经毒素复合物包含150 kD毒素分子和无毒无血凝性亚基以及5–6 ha17，4–5 ha23，3–4 ha48，和8–ha34亚基9。计算出的分子质量为一个复杂的化学计量比介于880~1000 kD之间。用尺寸排阻HPLC测定完整的复杂的分子质量（SE-HPLC）和多角度激光光散射检测，基于比较的标准蛋白的混合物，分子量SE-HPLC分析得到880 kD，光散射分析表明分子质量为925 kD ± 45 。
不难看出：
1. 文中对于保妥适的分子量给出的是一个大致的范围；
2. 用不同的方法测定分子量，得到的数值是不同的；
3. 文中用来测定保妥适分子量的参考的标准分子量蛋白质，叫“标准蛋白的混合物”。
标准分子量蛋白质，英文Protein Molecular WeightMarker，其实就是个参照物，分不同的重量，一般会是一套一套出售的，市面价200块。反正就是用这个标准，来测算想测定的蛋白质的重量。
原文里，保妥适使用的标准蛋白分子量最大为670KD，最小为44KD（A mixture of molecularweight standards containing thyroglobulin (Mr = 670 kDa), gamma globulin (Mr =158 kDa), ovalbumin (Mr = 44 kDa), and myoglobin (Mr = 17 kDa) (BioRad,Hercules, CA) was prepared according to the manufacturer’s instructions.）
“Adenaturing capillary electrophoresis method was developed to evaluate thesubunit stoichiometry of the Clostridium botulinum type A neurotoxin complex.The results indicate that the neurotoxin complex contains single copies of the150 kDa neurotoxin and the non-toxic non-hemagglutinating subunits as wellas 5–6 HA17, 4–5 HA23, 3–4 HA48, and 8–9 HA34 subunits. The calculatedmolecular mass for a complex with this stoichiometry is between 880 and1,000 kDa. The molecular mass of the intact complex was determined using size-exclusion HPLC (SE-HPLC) and SE-HPLC inconjunction with multi-angle laser light scattering detection. Based on acomparison to a mixture of standard proteins, SE-HPLC analysis yielded amolecular mass of 880 kDa while light scattering analysis indicated aweight average molecular mass of 925 ± 45 kDa. The closeagreement between the molecular mass values determined by the three approachessupports the subunit stoichiometry proposed for the C. botulinum type Aneurotoxin complex.”
——Lietzow MA,Gielow ET, Le D, Zhang J, Verhagen MF (2008) Subunit stoichiometry of theClostridium botulinum type A neurotoxin complex determined using denaturingcapillary electrophoresis. Protein J 27: 420–425.
文中提到的检测方法之一，就是size-exclusion HPLC，而使用同样的方法，2012年，何星等在《中国生物制品学杂志》上发表了《注射用A型肉毒毒素的生物学特性及连续质量分析》，文中统计了2009-2011年连续生产的注射用A型肉毒毒素原液的比活性数据，分析连续生产的工艺稳定性和质量重现性。里面的实验结论值得我们思考。
解读这个实验之前，我们先看下肉毒毒素复合物的组成：
一个肉毒毒素复合物含：
– 神经毒素分子（150kD）
– 非毒素非凝集素蛋白
– 血凝素（HA）蛋白
肉毒毒素复合物在pH=7.8的碱性条件下，神经毒素自动解离，使用AKTA Purifier层析系统进行阴离子交换层析，上样后用1mol/L NaCl线性梯度洗脱，分离毒素复合体各组分，并按照“样品比活（LD50/mgPr）=样品毒力（LD50/ml/样品蛋白浓度（mg/ml）”计算各组分的比活，采用血凝试验测定相对血凝效价。
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