板蓝根及其活性成分抗乙型肝炎病毒作用的机制：分子对接与实证

慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染仍是全球重大公共卫生问题，除了可导致慢性乙型肝炎，还与肝功能衰竭、肝硬化和肝细胞癌等终末期肝病的发生密切相关[1]。理想的慢性HBV感染治疗终点是获得“功能性治愈”，其定义为在抗病毒治疗结束后，乙型肝炎表面抗原（HBsAg）持续消失，HBV DNA检测阴性，转氨酶水平持续正常和肝脏组织学情况的改善[1]。

我国已批准临床用于治疗HBV感染的药物主要分为2类，一类是干扰素（interferon，IFN）类，一类为核苷（酸）类似物（nucleoside analogue，NAs）[2]。然而IFN类药物不良反应较大，血清学转换及治愈率有限[3]，虽然NAs可有效抑制病毒复制并降低肝脏相关并发症的风险，但单独长期使用NAs容易产生耐药而影响疗效，此外其对HBV抗原抑制性较差，难以实现HBsAg清除，获得功能性治愈的概率很小（仅为0.5%）[4]。因此寻找新的抗HBV治疗药物是当前临床面临的迫切需要。

板蓝根为十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥根，性苦、寒，归心、胃经，具有清热解毒、凉血利咽的功效，常用于温疫时毒，发热咽痛，温毒发斑，痄腮，烂喉丹痧，大头瘟疫，丹毒，痈肿[5]。板蓝根是中医临床上常用的清热解毒类中药，主要含有生物碱类、含硫化合物类、苯丙素类等19大类成分[6]。以往研究表明，板蓝根具有抗流感病毒、抗单纯疱疹病毒、抗呼吸道合体病毒、抗肝炎病毒、抗内毒素、抗氧化和调节免疫等多种药理作用[7-8]，尤其抗病毒、抗炎药效显著，一直是国内外研究的热点[6]。

板蓝根颗粒药物血清在体外细胞培养中能使HBV稳定复制细胞系HepG2.2.15细胞减少分泌HBsAg和乙型肝炎E抗原（HBeAg），作用8 d时能有效抑制HBeAg的分泌[9]。板蓝根多糖对HBV有抑制作用，其可能是由于IFN-α依赖性的Janus激酶（Janus kinase，JAK）/信号转导与转录激活子（signal transducer and activator of transcriptions，STAT）信号通路的激活和抗HBV蛋白表达的诱导[10]。然而板蓝根对HBV具有抑制作用的具体活性成分及作用机制尚需进一步明确。

慢性HBV感染时宿主呈现免疫耐受状态，激活机体的固有免疫应答是有望实现HBV功能性治愈的重要治疗手段。视黄酸（维甲酸）诱导基因I（RIG-I）样受体（RLRs）和Toll样受体（TLRs）是固有免疫中宿主细胞识别HBV的2类重要模式识别受体[11]，RLRs和TLRs与其配体结合之后，构象发生改变，从而招募特异的位于细胞质的接头蛋白，激活信号级联反应，引起I型IFN、促炎症细胞因子、趋化因子等一系列抗病毒因子的产生[12]。研究表明，慢性HBV患者的树突状细胞的RIG-I表达量明显低于急性HBV患者及健康人RIG-I的表达量[13]；乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）作为去泛素化酶作用于RIG-I通路中的多个环节，使多个接头蛋白激活受阻，导致I型IFN产生障碍[14]，提示RIG-I信号通路的激活对于HBV治疗具有重要意义。

本研究首先在HepG2.2.15细胞明确板蓝根对HBV的抑制作用，进一步从RIG-I-线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）信号通路角度探讨板蓝根的抗病毒作用机制，同时以该信号通路中的RIG-I、MAVS、IFN调节因子7（IRF7）蛋白为靶点，与板蓝根中的活性化合物进行分子对接，初步筛选板蓝根中调控该信号通路的活性化合物，从而明确板蓝根的抗HBV物质基础及作用机制。

1 板蓝根在细胞模型中的抗HBV作用

体外实验结果显示，板蓝根在HepG2.2.15细胞模型中的CC50为5.51 mg/mL，最大安全质量浓度为1.6 mg/mL（图1-A），板蓝根在给药后第5天的抗病毒作用最为显著（图1-B）。在HepG2.2.15细胞模型中，板蓝根（1.6 mg/mL）对HBV DNA、HBeAg、HBsAg的抑制率分别为54.67%、23.29%、66.62%（图1-C），TDF（200 μg/mL）对HBV DNA、HBeAg、HBsAg的抑制率分别为95.25%、11.16%、9.26%（图1-D）。

2 板蓝根对RIG-I-MAVS信号通路的调控作用

通过Western blotting方法对RIG-I-MAVS信号通路中各关键蛋白RIG-I、MAVS、IRF7、p-IRF7的表达进行检测，如图2所示，板蓝根对RIG-I、MAVS、IRF7、p-IRF7蛋白的表达均具有上调作用，对RIG-I蛋白的上调作用较为显著（P＜0.05、0.001），并且呈剂量相关性。

3 分子对接结果

在PDB数据库中检索的RIG-I、MAVS、IRF7的PDB格式结构分别为RIG-I（PDB ID：6KYV）、MAVS（PDB ID：2VGQ）、IRF7（PDB ID：3QU3）蛋白，在TCMSP数据库中共检索到板蓝根的主要活性成分共169个，使用Schrödinger软件将目标靶点与板蓝根主要活性成分对接后，导出对接结果，靶点RIG-I、MAVS、IRF7对接结果中结合能≤−5 kJ/mol的分别有46、83、41个活性成分。鉴于IRF7是I型IFN的上游因子，IRF7的磷酸化可直接诱导产生具有抗HBV作用的IFN，推测与IRF7结合能力最强的板蓝根活性成分有较强的抑制HBV作用的潜力。对接结果显示，与IRF7结合能力最强的是4-羟基-1H-吲哚-3-甲醛。此活性成分与RIG-I、MAVS也均具有较强的结合能力，与RIG-I、MAVS和IRF7的结合能分别为−5.218、−6.525、−6.813 kJ/mol。

IRF7与4-羟基-1H-吲哚-3-甲醛的分子结合模式如图3所示，化合物4-羟基-1H-吲哚-3-甲醛与IRF7蛋白两者间的疏水作用较弱，IRF7蛋白对4-羟基-1H-吲哚-3-甲醛不会产生较强的排斥作用（图3-A），4-羟基-1H-吲哚-3-甲醛与IRF7蛋白的活性口袋具有较强结合能力，芳香性较强，且能量分布均衡（图3-B、C），IRF7蛋白中的赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸与4-羟基-1H-吲哚-3-甲醛间有π-π键结合、赖氨酸与其以σ-π结合，此外还有谷氨酸、天冬氨酸与之形成氢键作用（图3-D）。

4 活性成分的抗HBV活性评价及机制探索

本研究通过分子对接方法初步筛选出潜在抗HBV活性化合物4-羟基-1H-吲哚-3-甲醛，与板蓝根同样，基于HBV稳定复制细胞系HepG2.2.15细胞对其进行抗HBV活性评价。如图4所示，4-羟基-1H-吲哚-3-甲醛对HepG2.2.15细胞的CC50＝135.8 μmo/L，最大安全浓度为40 μmol/L，最佳作用时间与板蓝根同为第5天。在安全浓度下，4-羟基-1H-吲哚-3-甲醛对HBV DNA的最大抑制率为33.87%，对HBeAg、HBsAg的抑制率分别为28.14%、46.14%，阳性对照药物TDF对HBV DNA、HBeAg、HBsAg的最大抑制率分别为93.0%、6.69%、10.55%。

此外，为了比较4-羟基-1H-吲哚-3-甲醛与板蓝根抗HBV的异同及效率，同时测定二者与TDF的抗HBV活性。如图5所示，板蓝根、4-羟基-1H-吲哚-3-甲醛、TDF对HepG2.2.15细胞HBV DNA的最大抑制率分别为45.13%、34.6%、94.68%，对HBeAg的最大抑制率分别为38.39%、21.78%、14.83%，对HBsAg的最大抑制率分别为73.85%、25.35、22.57%。板蓝根和4-羟基-1H-吲哚-3-甲醛均可以显著抑制HepG2.2.15细胞HBsAg分泌（P＜0.05、0.01、0.001），但4-羟基-1H-吲哚-3-甲醛对HepG2.2.15细胞HBeAg的分泌无明显的抑制作用；此外二者均可以显著抑制HBV DNA的分泌（P＜0.05、0.01、0.001）。

为了验证4-羟基-1H-吲哚-3-甲醛对RIG-I-MAVS信号通路是否具有调控作用，采用Western blotting方法检测其处理细胞5 d后的蛋白样品中RIG-I、MAVS、IRF7、p-IRF7蛋白的表达情况，如图6所示，4-羟基-1H-吲哚-3-甲醛可不同程度上调RIG-I、MAVS、IRF7、p-IRF7蛋白表达，对RIG-I蛋白的上调作用最为显著（P＜0.05）。

讨论

在HBV生命复制周期中，HBV前基因组RNA（pre-genomic RNA，pgRNA）由感染肝细胞核内的共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）转录产生。研究显示，RIG-I可识别pgRNA并诱导IFN-λ的表达；此外，RIG-I可依赖以RNA结合的方式阻止HBV聚合酶P蛋白与pgRNA的5’-ε区相互作用，从而抑制HBV复制，基于病毒RNA-RIG-I相互作用的先天防御机制，其中RIG-I不仅是激活IFN反应的HBV传感器，而且可作为一种直接的抗病毒因子发挥作用[16]。

在RIG-I通路中，RIG-I首先识别外源RNA而被激活，然后通过半胱天冬酶募集结构域（caspase recruitment domain，CARD）与位于线粒体外膜的MAVS的CARD结构域相互作用，MAVS被激活后在线粒体上形成朊病毒样聚集体，募集下游激酶，从而磷酸化IRF7，调节IFNs和干扰素刺激基因（interferon-stimulated genes，ISGs）的表达。IFN-β可以通过招募STAT1与STAT2与α/β干扰素受体（interferon-α/β receptor，IFNAR）结合，导致这些分子的二聚、核易位和与IRF9结合，形成ISG因子3复合体。然后复合体结合到ISG启动子中IFN刺激的响应元件上，导致ISG转录的激活。通过这种方式，IFN-α/β诱导数百个ISGs的表达，其中大量ISGs在细胞内诱导抗病毒状态[17]。

本研究通过分子对接的方法，选取机体固有免疫应答RIG-I-MAVS信号通路中的RIG-I、MAVS、IRF7作为激活诱导I型IFN分泌的抗HBV靶点，筛选了板蓝根中具有潜在抗HBV的活性成分，根据分子对接结果显示板蓝根中的4-羟基-1H-吲哚-3-甲醛与RIG-I、MAVS、IRF7蛋白均有较强的相互作用，对其进行抗HBV生物活性验证，同时对其作用机制进行初步探索。

板蓝根在HBV稳定复制HepG2.2.15细胞系上具有抑制HBV DNA、HBsAg、HBeAg作用，4-羟基-1H-吲哚-3-甲醛在HepG2.2.15细胞上也可一定程度上抑制HBV DNA、HBeAg、HBsAg的分泌。Western blotting实验结果显示，板蓝根和4-羟基-1H-吲哚-3-甲醛均上调了RIG-I、MAVS、IRF7、p-IRF7蛋白的表达。RIG-I作为IFN通路激活表达的ISG基因，在IFN通路活化后也会增强表达，提示板蓝根及其活性成分4-羟基-1H-吲哚-3-甲醛可能通过直接上调RIG-I蛋白表达，同时间接增加RIG-I等IFN信号通路分子的蛋白表达水平，进一步增强IFN信号通路的活化，执行其抗病毒作用。

综上，本研究通过分子对接技术与药理学实验结合，首次从RIG-I-MAVS信号通路的角度阐明了板蓝根的抗病毒作用免疫学机制，并初步发现其抗病毒有效成分4-羟基-1H-吲哚-3-甲醛，为板蓝根的抗病毒临床应用与深入研究提供了参考。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：曹梦珍，赵 旭，郑艳芳，葛斐林，思兰兰，李 乐，王伽伯，刘 妍，肖小河．基于分子对接与实验验证的板蓝根及其活性成分抗乙型肝炎病毒作用机制研究 [J]. 中草药, 2023, 54(7):2127-2134.