（原创内容，转贴须注明出处 http://www.dxy.cn/bbs/topic/29211004） 检测T细胞免疫状态的干扰素-γ（IFN-γ）释放检测试验（interferon-γ release assays，IGRA），是近些年广受重视的一个实验方法。因其可特异、直观地显示T细胞对于某特异性抗原的免疫状态，在基础免疫学研究领域已得到广泛应用。因其操作较复杂，耗时长，在临床检验领域还不算普及，但在个别项目，IGRA却显示出良好的生命力。
这个别项目， 就是结核杆菌感染效应T细胞分泌IFN-γ检测试验，开展此项检验的临床实验室越来越多，跟进开发此产品的厂家也越来越多。
先说说IGRA的原理：T细胞在被特异性免疫原激活后，再次遇到该免疫原时，会分泌干扰素-γ。据此，可在体外用特定免疫原刺激T细胞，检测其IFN-γ分泌情况，从而推断其在体内时是否已被该免疫原免疫过。
肺结核（及其他结核病）的实验室诊断一直是个难题。痰培养和痰涂片染色的阳性率低，容易漏诊；结核菌素皮肤试验则假阳性率太高，临床应用意义严重受限。目前市面上常见的结核抗体检测试剂盒，其临床意义也广受争议。即便是通过核酸扩增的方法检测痰液或其他标本，结果仍不能完全让人满意。IGRA法检测结核杆菌感染，就是在这样的背景下发展起来的，堪称数十年来结核病实验室诊断技术发展的一个里程碑。
在已上市产品中，具体实验操作设计层面，有两种不同的方向。一种是全血添加免疫原，孵育适当时间后，通过ELISA双抗夹心法检测血浆中IFN-γ的含量；另一种是从全血中分离出单个核细胞（主要是淋巴细胞），配成适当浓度的细胞悬液，与免疫原同时加入已包被IFN-γ抗体的板孔中，孵育一定时间后，加入已标记过氧化物酶或碱性磷酸酶或者其他生物素的IFN-γ抗体，通过所标记生物素的催化特性进行显色反应，使板孔底部形成有色斑点，根据斑点数量作出结果判断，一般称这种方法为酶联免疫斑点试验（(Enzyme Linked-immunospot Assay，ELISPOT）。
IGRA-ELISA法的代表产品有澳大利亚产的QFT，IGRA-ELISPOT的代表产品有英国产的T-SPOT，均已获得CFDA注册许可，已在国内正式上市。国内还有多种仿制产品上市，两种方法都有。
版主zhulikou431留言:
支持原创，加分。
1、IGRA技术对结核病诊断的意义何在？
IGRA技术能准确地判断受试者体内是否有结核杆菌，即判断感染的有无。这是一个很大的进步，之前的实验室检查没有哪项能做到这点。
2、IGRA技术为何能准确判断感染有无？
在目前已上市的检测试剂盒中，均同时使用CFP-10和ESAT-6两种免疫原（有些还有其他），这些蛋白为结核杆菌所特有，其他分枝杆菌、卡介苗均无。所以能获得较高的特异性。当然，假阴性和假阳性还是有的……检验师都能理解，呵呵。一般来说，试剂盒质量过硬、实验室质控良好的前提下，仅从方法学缺陷角度分析，在与临床不符的结果中，假阳性很少，假阴性稍多些。值得注意的是，已有厂家尝试在试剂盒中加入更多种类的免疫原，以期获得更高的阳性率。这是非常好的尝试。 不过，筛选出合适的免疫原、研究出能稳定批量获取该免疫原的方法、放进试剂盒里最终取得CFDA注册许可……不是件容易的事儿，没两把刷子的团队是搞不定的。
3、IGRA试验阳性就是结核病吗？
不是的。IGRA试验阳性预示有结核杆菌感染，但不等于就是结核病。临床医生称之为活动感染（结核病）和潜伏感染。
4、潜伏感染需要治疗吗？
这是个很让人挠头的问题。综合文献和专家讲座，我目前的理解是，像中国这样的高感染率背景情况下，提示有感染、现在未发病、未来也不发病的人群大量存在，在仅有IGRA试验阳性提示潜伏感染，没有其他临床指征和辅助检查结果提示发病证据的情况下，不建议进行治疗。但在低感染率背景地区（例如欧美发达国家），哪怕是仅有IGRA试验阳性，也应引起足够重视，可给予预防性治疗，至少是密切随访。在高感染率背景地区，对于高危人群、特殊人群，例如结核病房医护人员和其他密切接触者，婴幼儿，免疫功能低下者（例如HIV），对IGRA试验阳性者也应给予足够重视，可给予预防性治疗，至少是密切随访。
5、活动性结核病人，治疗后IGRA试验会转为阴性吗？换言之，这个试验的结果可以用来作为疗效观察乃至预后判断的依据吗？
相当比例、甚至是大部分、乃至几乎所有结核病人，结核病治愈后，体内仍可能会有数量极少的“休眠”的结核杆菌。所以，后一个问题的答案是：不能。也就是说，除非对试验结果本身的正确性有怀疑，否则，对已经检测过IGRA试验结果是阳性的受试者，复查的意义并不大。
6、IGRA阳性试验结果的强弱程度，也就是IFN-γ的浓度（ELISA法）、及斑点数（ELISPOT法），能提示体内结核杆菌数量、或活动程度吗？
不能。
7、ELISA和ELISPOT两种方法学，孰优孰劣？
各有优劣。ELISPOT是先来者，在国内普及应用是最近几年才“热”（2010年获得CFDA注册），但在国际上进入临床应用实际上已经超过10年了。与ELISA法比，缺点是操作过程相对复杂，需要分离单个核细胞，需要做细胞计数以制备合适的细胞悬液，判读结果时需要使用斑点计数仪，这不是一台通用的检验设备——当然也可以人工计数斑点，但挺麻烦。但其优点是，当受试者外周血T细胞数量很少、和/或者T细胞功能低下时，因有专门分离和制备单个核细胞的步骤存在，能显著减少这部分患者的假阴性率。ELISA法的优缺点则正好反过来，孵育过程相对简单，ELISA试验操作属于临床检验部门常规操作，可直接上自动酶标仪（如果有的话），缺点是遇到细胞免疫功能低下的受试者，假阴性率会高于ELISPOT法。
8、这个项目的临床应用前景和检测试剂盒产品市场前景如何？
综上所述，对于初诊病人，进行IGRA测试还是很有必要、很有意义的。据相关报道，中国大陆地区每年新增肺结核病人一百多万。如果说需要鉴别诊断的总人数是1000万，应该不夸张吧。目前各厂家的售价，每人份测试大约是300~500元。去算算吧，潜在市场有多大。
目前，结核菌素皮肤试验还在中国广泛开展，因其廉价、方便。但从临床意义角度分析，IGRA试验已可完全取代结核菌素皮肤试验。事实上，美国CDC已经要求使用IGRA试验全面取代结核菌素皮肤试验，淘汰后者。中国没有跟上，应该主要还是考虑成本问题，及基层实验室的测试能力问题。
目前，中国仍普遍使用X线检查来对健康人群进行肺结核体检普查。显然，这是不合理的。但若结核病普查是必须，那舍此似乎又无他法。现在，有了IGRA，我们不妨大胆想象，未来是否可能先用IGRA筛查，阳性者再进行射线检查呢？固然，昂贵的价格，高比例感染的背景，都是实现这个可能的制约因素，但无论如何，这必将是未来一个可能的应用增长点。
9、这个项目检测产品的技术走向会如何？或者说还可以做哪些工作？
①寻找和添加新的免疫原，提高阳性率。理想免疫原：为结核杆菌所特有；免疫原性强；易于提取制备且性质稳定；
②研发配套自动化仪器，做成像糖化那样的专用机器；
③检测干扰素-γ环节，采用更多免疫检验方法学，例如化学发光、免疫荧光层析等。
10、IGRA是否可以应用于更多其他临床免疫学实验项目？
理论上可以，但实践层面目前有障碍。特异性好、灵敏度高是它的显著优点。缺点是操作繁琐耗时长。对于基础研究实验室也许这不是大问题，但对于临床检验实验室这是死结。像结核病这样的，体液免疫过程找不到合适的标志物用于辅助诊断，IGRA才会有机会。这是目前的状况，未来就不好说，随着技术发展，一切皆有可能。
11、分享主流厂家的产品说明书：
结核感染T细胞检测试剂盒（免疫斑点法）说明书（英国T-SPOT）
http://d.dxy.cn/detail/7352851 结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒（酶联免疫法）说明书（澳大利亚QFT）
http://d.dxy.cn/detail/7352847 本版是医疗器械版，所以就来谈谈这个项目的开发，包括技术开发和注册申报。当然，这个只能纸上谈兵，点到即止哈。
这个产品属于三类体外诊断试剂产品。有二类、三类免疫诊断产品开发经验的团队，纯技术层面，做好这个产品的难度不会太大。但有些第三方资源恐怕会成为制约的瓶颈。
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首先说说主要原材料，包括干扰素-γ抗体（包被一抗）及标记了生物素的干扰素-γ抗体（标记二抗），免疫原，ELISA法还需要干扰素-γ（配制校准品）。干扰素-γ有不同渠道不同来源的成熟市场供应，也可通过基因工程的方法自制。一抗和二抗目前市场上有零星销售，但供应还难说成熟与稳定，需要花点力气找到渠道，或者干脆自制。
免疫原是个重头戏，用什么免疫原，相当程度上决定你的产品是个什么样的产品。CFP-10、ESAT-6是常规必备，所有已上市产品均使用了这两个免疫原，有的产品仅有这两种免疫原，有的则是2+x。理论上来说，使用更多免疫原，可以获得更高的阳性率，减少假阴性，但实际效果如何，还有待用户验证。免疫原目前市场上没有可靠的供应，必须由厂家自制。这不是个轻松活儿，厂家需有过硬的蛋白制备和纯化技术。
ELISA法还需要干扰素-γ标准品。可轻易买到干扰素-γ纯品，研发工作的重点是量值溯源。
试剂盒中各组分的剂型，值得开发者慎重考虑。冻干粉，用户操作复杂，但稳定性应该会更可靠些；液体则相反。开发者应根据实验研究验证情况结果找到折中点。
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再说说临床试验。
三类体外诊断试剂产品，至少三家医院总数至少1000例试验，这是法规的强制要求，没什么好说的。试验类型当然选择与同类已上市产品比对。医院选择方面，宜选择结核病专科医院，符合要求的样本数量容易得到保证。选择对照产品，应尽量选择与试验产品方法学一致的产品。
应特别注意，试验产品与对照产品使用的免疫原是否完全一致。如不一致，方案和报告中须有所体现。
本帖在检验版的讨论：
http://www.dxy.cn/bbs/topic/29215591版主zhulikou431留言:
加分鼓励。
写得好！顶楼主！
“ 5、活动性结核病人，治疗后IGRA试验会转为阴性吗？换言之，这个试验的结果可以用来作为疗效观察乃至预后判断的依据吗？
相当比例、甚至是大部分、乃至几乎所有结核病人，结核病治愈后，体内仍可能会有数量极少的“休眠”的结核杆菌。所以，后一个问题的答案是：不能。也就是说，除非对试验结果本身的正确性有怀疑，否则，对已经检测过IGRA试验结果是阳性的受试者，复查的意义并不大。”
就第五点来看，如果结核病人治愈后，体内还存在少量结核杆菌，那就是说，对于既往感染的病人，IGRA检测还会是阳性？那这样检测结果就没有很高的准确性啊，有的病人在以前可能感染过结核，但是通过自身免疫力清除掉了，那现在进行检测还会是阳性的话，那就代表不了是不是现行感染。
求楼主解答！
nemocool
“ 5、活动性结核病人，治疗后IGRA试验会转为阴性吗？换言之，这个试验的结果可以用来作为疗效观察乃至预后判断的依据吗？
相当比例、甚至是大部分、乃至几乎所有结核病人，结核病治愈后，体内仍可能会有数量极少的“休眠”的结核杆菌。所以，后一个问题的答案是：不能。也就是说，除非对试验结果本身的正确性有怀疑，否则，对已经检测过IGRA试验结果是阳性的受试者，复查的意义并不大。”
就第五点来看，如果结核病人治愈后，体内还存在少量结核杆菌，那就是说，对于既往感染的病人，IGRA检测还会是阳性？那这样检测结果就没有很高的准确性啊，有的病人在以前可能感染过结核，但是通过自身免疫力清除掉了，那现在进行检测还会是阳性的话，那就代表不了是不是现行感染。
求楼主解答！
“既往感染”，如果体内已经没有结核杆菌，不会阳性。因为T细胞的寿命有限。
我上文的意思是，结核病人临床治愈，实际上体内往往还会有结核杆菌——这种状态，不是“既往感染”，呵呵。
支持！
小强是蟑螂
“既往感染”，如果体内已经没有结核杆菌，不会阳性。因为T细胞的寿命有限。
我上文的意思是，结核病人临床治愈，实际上体内往往还会有结核杆菌——这种状态，不是“既往感染”，呵呵。
谢谢，那就是说，对于现行感染、潜伏感染以及感染治愈后的病人，通过IGRA检测，结果都会是阳性，是吧？
那我还想请教一下，对于检测结果，在同样都是阳性的情况下，不同病人检测结果之间的差异能代表什么？一个值是55，一个值是140，这能说明严重程度吗？
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