作者 北京朝阳医院 王鹏 刘颖梅
首先，我们看看各位读者的选择。
有60%的读者认为致病细菌是厌氧球菌，而菌种鉴定却答案不一，超过3成的读者认为是消化链球菌，其次是颗粒链球菌或乏养球菌。下面我们来了解一下真实的鉴定过程。
【耐氧试验：确定为需氧菌】
血培养虽然是厌氧瓶报警，但仍然需要做耐氧试验。耐氧试验需要转种：1.厌氧血平板置于厌氧环境，2. 普通血平皿和巧克力平板分别置于空气和CO2环境。此例将菌株转种到血平板和巧克力平板，在空气环境培养，均未生长；而在CO2培养箱中培养48小时后，普通血平板和巧克力平板均有菌落生长，因此确定该菌是兼性需氧菌，而不是厌氧菌。菌落涂片的分析，应该是球菌为主，并成链状生长。
因此：第一问的答案应该为：需氧的革兰阳性球菌。小编似乎已经看到了各位惊讶的表情，不过没关系，我们继续看看后面发生了什么。
【常规生化鉴定】
当涂片呈现多形性革兰阳性菌呈链状或成对排列，且为需氧菌、触酶阴性时，应按照图4显示的思路进行鉴定。对于需氧链球菌来说，下列试验非常重要，PYR、LAP、多盐、万古霉素敏感性、胆汁七叶苷等。
由于本例普通血平皿不生长或生长不良时应考虑乏养菌属及颗粒链球菌属。此菌属在不含吡哆醛或L-半胱氨酸的普通血平皿不生长或生长不良。怀疑这类菌时，应使用含盐酸吡哆醛的血培养基做卫星试验，也可使用接种金葡后的普通血平皿做卫星试验（金葡溶血后可以提供细菌生长所需要的营养如：盐酸吡哆醛等，出现细菌围绕金葡生长的现象）。
本例PYR（＋）、LAP（＋）、万古霉素为S（图5）；卫星试验阳性；在高盐环境中不生长（—）（图6）、胆汁七叶苷（—）、精氨酸（—）、β-葡萄糖酸苷酶（—），据此初步鉴定为乏养菌属。
图4示：触酶阴性、成对、四联、成堆或不规则排列的需氧革兰阳性球菌的鉴定法则
图5：万古霉素敏感
图6：6.5%NaCl培养不生长
经API 20 Strep 鉴定结果为缺陷乏养菌，鉴定率99.2%，T值0.64，生物编码为：1350051，如图7所示。随后，采用全自动快速微生物质谱检测系统VITEK MS鉴定，结果缺陷乏养菌。
图7：API 20 Strep鉴定结果
【鉴定结果确认-测序法】
为了确保鉴定结果的准确性，使用分子诊断的方法扩增细菌的16SrRNA，引物序列是27f：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’和1492r：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’，将PCR产物测序比对，结果确认为缺陷乏养菌。
【讨论】
缺陷乏氧菌为革兰阳性苛养菌，成链状排列，但常以多型的、球杆样的形态为人们所知。早在1961年此菌被认为是营养变异链球菌（NVS）中的一员[1]。直到1989年Bouvet等通过DNA-DNA杂交研究证明，这种细菌从分类学上与链球菌属其他细菌相差甚远，从而提出了缺陷链球菌和毗邻链球菌[2]的分类概念。然而1995年日本科学家Kawamula等利用16S rRNA序列分析发现，这两细菌是属于乏养菌属，而非之前所说的链球菌属，从而将这两类菌更名为缺陷乏养菌和毗邻乏养菌[3]。在2000年时，Collins 和Lawson利用16S rRNA的异质性和表型差异，对乏养属进行了重新的分类，乏养属仅保留缺陷乏养菌一种，其余全部归为颗粒链菌属[4]。因此，缺陷乏氧菌是乏氧菌属中的唯一成员。
缺陷乏养菌自身生长有独特的营养需求。与其他的链球菌相比，它生长较为缓慢，因此培养和鉴定通常比较困难[1, 5]。缺陷乏养菌通常要延长培养时间，而且，由于其营养需求的特殊性，要在固体培养基中加入维生素B6和L-半胱氨酸以维持其生长[2]。在我们的病例中分离出的缺陷乏养菌在CO2环境下，普通血平板上生长良好，这与以往研究有所区别[6]。
由于缺陷乏氧菌的形态特征不典型，呈现多型性；而且作为一个苛养菌分离条件要求较高、鉴定比较困难；加之此菌很少从临床标本中分离，技术人员对其形态特征不是非常熟悉，所以临床实践中很容易出现漏检或鉴定错误。在我们这个病例中分离的缺陷乏氧菌仅在厌氧瓶及厌氧平皿中生长，培养后菌落涂片与血培养瓶中的直接涂片形态差异很大，给分离鉴定增加了难度。
目前，对乏氧菌的体外抗菌药敏感性检测还没有统一的标准。有研究利用草绿色链球菌非肺炎双球菌的CLSI标准作为对照，对11株NVS(其中包括3株缺陷乏养菌)进行体外药敏试验。结果表明，3株缺陷乏养菌中，除1株对青霉素耐药外，其余均对青霉素、头孢曲松、美罗培南、克林霉素、红霉素，奎奴普丁 / 达福普丁,左氧氟沙星,万古霉素和替考拉宁等抗生素敏感[7]。另一篇来自美国的报道，12株缺陷乏养菌对青霉素、阿莫西林、头孢曲松和美罗培南的敏感率分别为8%、92%、83%和100%[8]。本病例中，患者血培养确诊为缺陷乏养菌血症后，将抗生素调整为美罗培南和甲硝唑，较病情最严重（出现菌血症表现）时有所好转。
缺陷乏氧菌是口腔、泌尿生殖道和肠道的正常菌群之一[9]。近年来，该菌引起感染性疾病的报道不断增多，特别是在免疫力低下的患者引起菌血症[10]，感染性心内膜炎[11]，脑脓肿[12]等。该例患者也是一名接受化疗后的食管癌患者，由于免疫力低下，继发血流感染，引起典型的菌血症临床表现。
【参考文献】
1.Frenkel, A. and W.Hirsch, Spontaneous development of Lforms of streptococci requiring secretions of other bacteria or sulphydrylcompounds for normal growth. Nature, 1961. 191: p. 728-30.
2.Bouvet A, G.F.,Grimont P., Streptococcus defectivussp.nov. and Streptococcus adjacens sp. nov., nutritionally variant streptococcifrom human clinical specimens. Int J Syst Bacteriol, 1989. 39: p. 290-294.
3.Kawamura, Y., et al., Transfer of Streptococcus adjacens andStreptococcus defectivus to Abiotrophia gen. nov. as Abiotrophia adiacens comb.nov. and Abiotrophia defectiva comb. nov., respectively. Internationaljournal of systematic bacteriology, 1995. 45(4):p. 798-803.
4.Collins, M.D. and P.A.Lawson, The genus Abiotrophia (Kawamuraet al.) is not monophyletic: proposal of Granulicatella gen. nov.,Granulicatella adiacens comb. nov., Granulicatella elegans comb. nov. andGranulicatella balaenopterae comb. nov. International journal of systematicand evolutionary microbiology, 2000. 50Pt 1: p. 365-9.
5.Ruoff, K.L., Nutritionally variant streptococci. Clinical microbiology reviews,1991. 4(2): p. 184-90.
6.Hashimoto, T., et al., A woman with infectious endocarditis caused by Abiotrophia defectiva.Internal medicine, 2004. 43(10): p.1000-4.
7.Senn, L., et al., Bloodstream and endovascular infections due to Abiotrophia defectivaand Granulicatella species. BMC infectious diseases, 2006. 6: p. 9.
8.Tuohy,M.J.,G.W.Procop,andJ.A.Washington. Antimicrobial susceptibility of Abiotrophia adiacens and Abiotrophia defectiva.Diagn.Microbiol.Infect.Dis.2000. 38:189-191
9.Christensen, J.J. and R.R. Facklam, Granulicatella and Abiotrophia species fromhuman clinical specimens. J Clin Microbiol, 2001. 39(10): p. 3520-3.
10.Woo, P.C., et al., Granulicatella adiacens and Abiotrophiadefectiva bacteraemia characterized by 16S rRNA gene sequencing. J MedMicrobiol, 2003. 52(Pt 2): p.137-40.
11.Chang, H.H., et al., Endocarditis caused by Abiotrophia defectiva in children. PediatrInfect Dis J, 2002. 21(7): p.697-700.
12. Cerceo,E., et al., Central nervous systeminfections due to Abiotrophia and Granulicatella species: an emergingchallenge? Diagnostic microbiology and infectious disease, 2004. 48(3): p. 161-5.
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