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作者：螺丝钉Ｗ
解螺旋出品
解螺旋今天与大家分享的内容源于在解螺旋lncRNA俱乐部分享过的、来自NAT GENET的相关文献（IF=29.648)（索要原文请在解螺旋公众号中回复0507），对lncRNA感兴趣的小伙伴，欢迎仔细品读。加入lncRNA俱乐部可以加解螺旋助手为好友并提出您的要求（助手微信号：helixlife0）。
摘要翻译
lncRNA可充当基因调控元件，对外界刺激产生应答，调节基因活性。但这种活性的调节范围和功能尚不清楚。作者使用108个具有不同外界刺激的人的组织标本，采用超高密度阵列，对56个细胞周期相关基因的启动子进行筛选。鉴定了216个可能编码lncRNA的转录区域，RT-PCR验证了他们中的一些分子在细胞周期循环过程中周期性的表达。提示这些分子在肿瘤中的表达改变，与特定的致癌刺激、干细胞分化或DNA损伤有关。在CDKN1A启动子区，DNA损伤诱导了5个lncRNA分子的表达。将其中的一个lncRNA命名为PANDA，其诱导表达具有p53依赖性。PANDA与转录因子NF-YA相互作用，抑制了促凋亡基因的表达；PANDA缺失导致人成纤维细胞对阿霉素诱导的细胞凋亡更加敏感。以上结果表明，启动子表达的lncRNA在细胞生长控制方面有广泛的作用。
研究思路
研究者最开始通过对56个基因的启动子区域进行筛选，获得216个转录本；然后通过大量的生物信息学分析，证实了他们都是lncRNA。然后通过gene module map将范围缩小到60个转录本（都与细胞周期或ESC相关），然后通过阿霉素刺激细胞模型，缩小到几个转录体，最后由于PANDA 的表达变化是最强的（40倍），将研究的重点放在了PANDA上。
筛选细胞周期相关的lncRNA的流程图
推荐理由
一般来说，如果要进行lncRNA的芯片筛选，会获得海量数据。如何分析这些数据？
有时候，我们可以委托公司或者有生物信息学背景的人来做，但委托者更多还是依赖我们的思路来做。因此提出分析的思路是最为关键的。
“这篇文章之所以很有借鉴意义，是因为大多数CNS级别的文章，对于怎样通过筛选获得候选分子，介绍得语焉不详。而是重点就筛到的候选分子，对其功能做了大量的研究工作。这篇文章正好反其道而行之，对于PANDA的功能做得不多。反而着重介绍了如何筛选研究对象并逐步缩小范围，最后就感兴趣的lncRNA（PANDA）进行深入研究。”
研究内容
第一步 筛选转录起始位点（TSS）的RNA
在转录起始位点附近，RNA聚合酶常常可以产生20-200nt的转录产物，被称为启动子相关小RNAs（RASRs）。这些分子是有功能的，还是仅仅是转录副产物，不得而知。
作者就聚焦TSS区附近转录的非编码RNA进行筛选和分析。在做筛选时，作者证实了绝大多数（41/56）的exon 1 都能被检测到，说明3’bias 现象不存在（分辨率是5个nt，很可能出现5个T的探针。如果出现5个T的探针，和RNA的3’poly A 区域容易形成互补，即是所谓的3‘bias 现象）。
首先，用来源于各种干扰下的人类细胞，包括细胞周期同步改变、DNA损害、分化刺激、致癌的刺激，进行复瓦市微阵列，总共选取了56个基因，研究位置在9p21区（此区域包括p16、p14、p15）的25 kb 分辨率5nt 、 TSS上游10kb、TSS下游2kb。
调用算法峰值寻找统计上最明显的信号，并找到至少有50kb的连续区域。最后确定了216个离散的转录区域，平均每个样本中有73个不与细胞周期基因重叠的转录区。平均长度234nt。171个在TSS的5’端，40个在内含子区，5个在TSS的3’端下游。
（1）CHIP-chip检测结合EpiGRAPH分析，证实这216个转录区是普遍转录的。
（2）CSF验证结合BLAST分析，这些分子不编码蛋白。
（3）另外，这些转录产物都不含有miRNA前体，小核仁RNA等。
以上特征，与lncRNA相符。
将这些杂交信号与TSS做对比，发现一个高峰，正在TSS下游与exon1对应。并且发现在TSS上游4~8kb处富集非编码RNA。
第二步：证明这些候选lncRNAs具有生物学功能
在这216个转录产物中，有92个转录产物至少有2倍或以上的表达变化。这些发生变化的转录产物大部分参与了干细胞通路（40个）、浸润性乳腺导管癌（35个）。进一步分析，发现干细胞和肿瘤干细胞所引起的lncRNA的变化具有极大的相似性。最后，通过GO 分析，发现这216个转录产物可以分成三个簇，主要参与的细胞周期、自我更新和肿瘤发生。
第三步：了解lncRNA的作用机制是顺式还是反式
lncRNA与同源mRNA间的表达是否有关？
17组全基因组表达测序，计算lncRNA和mRNA的相关皮尔森系数。发现无关，推测lncRNA不起顺式作用。
已有报道发现lncRNA可以发挥顺式作用，即指上游的lncRNA转录后，通过调控其下游的mRNA（lncRNA的位点loci与mRNA靠得很近）的转录。但是通过筛选及分析发现lncRNA与其附近的mRNA 之间的表达没有相关性，因此排除了顺式作用。
lncRNA与别处的基因表达是否相关？
针对每一个lncRNA，研究者都选取了一组mRNA（入组mRNA 条件是与该特定的lncRNA的表达呈现正相关或者负相关），通过分析这个gene module map，发现多个lncRNA与多种生物学途径紧密相关，包括细胞周期、DNA重组、RNA 剪切、DNA 损伤应答等。
第四步：验证lncRNA在细胞周期、ESC分化、癌症和DNA损伤反应中表达
作者挑选了60个lncRNA进行研究（如何挑选的未明确说明，估计是针对上面的gene module map 进行挑选的。挑选的基因都是与细胞周期，ESC 相关）
qRT-PCR验证了60个lncRNA在不同的情况下有不同的表达方式和作用。在Hela细胞和fibroblast 细胞中，这些lncRNA的表达，都呈现出一个随时间而变动的调控方式（即随着时间的变动，都有峰值出现，而且这些峰值往往和细胞周期相对应）。提示这些lncRNA参与了细胞周期的变化。
通过ESC （有干性，未分化）和 fetal pancreas（分化终末细胞）的比较，显示出这些lncRNA在分化的过程中，受到显著地调控。
类似地，可以发现正常地乳腺组织和转移性乳腺癌组织中，lncRNA的表达也呈现显著地差异。
从这一步开始，研究者已经把筛选到的216个转录体，缩减到60了。而且这60个都是和ECS及细胞周期相关的。研究内容已经开始越来越聚焦了，为后面focus 到 PANDA 打下了基础。
第五步：聚焦其中一个lncRNA验证其功能
接下来作者就锁定目标了。通过共表达图谱预测到一些lncRNA和DNA损伤有关。阿霉素刺激的胎儿肺成纤维细胞，有12个lncRNA的表达出现至少2倍的改变。其中，2个位于p53目标基因CDKN1A (也叫p21)的TSS的5’端，这两个lncRNA与CDKN1A mRNA 相似的地方是，都可以受到阿霉素刺激的调控（阿霉素刺激是研究DNA损伤的经典方法），提示这两个lncRNA参与了DNA损伤反应。将60个lncRNA放在胎儿肺成纤维细胞模型中，阿霉素刺激24h，观察他们的表达情况，发现CDKN1A上游的一些lncRNA反应迅速明显。在这些lncRNA中，CDKN1A-4845 的表达高达40倍（文中之后将其称为PANDA），提示这条lncRNA可能在DNA损伤反应中起到重要的作用。
以上说明CDKN1A区域的lncRNA可能在DNA受损反应下与p21相互作用。
最后，siRNA的方法对PANDA进行功能验证。
PANDA，一种长链非编码未经剪切的1.5kb lncRNA，由CDKN1A的反义链转录，动力学比CDKN1A更快。
功能缺失和互补实验表明，PANDA在DNA损伤是依赖于p53的感应。
敲除CDKN1A或PANDA对彼此的DNA损伤反应无影响，说明他们的作用是平行的。
PANDA通过将转录因子NF-YA与靶基因启动子隔离，阻滞凋亡基因表达，增强细胞存活。
在CDKN1A位点的编码和非编码mRNA协调DNA损伤反应的模式图
作者背景
通讯作者供职于斯坦福大学，主要研究基因在空间与时间上的功能，目前主要的研究方向是这些基因如何在lncRNA的调控之下，进行表达和发挥功能。
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