核苷/核苷酸类似物治疗中乙肝病毒表面抗原的长期动力学：
有限疗程没有可能
背景和目的：有关核苷/核苷酸类似物治疗过程中HBsAg长期动力学的资料非常有限。本研究旨在评估慢性乙型肝炎患者生存期内是否有望接受有限疗程核苷/核苷酸类似物治疗。
方法：对采用核苷/核苷酸类似物多个不同治疗方案的慢性乙型肝炎患者，进行了中位时间为102个月，即8.5年（四分位数间距为88～119月）的长期随访。根据HBV DNA和HBsAg水平的长期动力学数据建立数学模型，推算抗病毒治疗中HBV DNA不可测患者清除HBsAg的时间。
结果：抗病毒治疗之后，大多数患者的HBsAg水平持续缓慢下降，呈三种模式：（1）HBV DNA可测和不可测阶段均下降；（2）仅在HBV DNA不可测阶段下降；（3）仅在HBVDNA可测阶段下降。HBV DNA达到不可测时的HBsAg平均滴度为3.29±0.49log10IU/mL，平均斜率为-0.007±0.007log10IU/月，即年平均下降值为0.084log10IU。据此计算出相应的清除HBsAg中位时间为52.2年（四分位数间隔为30.8～142.7）。
结论：本研究对接受强效核苷/核苷酸类似物治疗方案的慢性乙型肝炎患者进行了很长时间的随访。随访结果提示，在患者生存期内，即使HBV 复制得到良好抑制，仍无可能清除HBsAg。因此，绝大多数HBV感染者需要终身治疗。
关键词：乙型肝炎病毒；乙型肝炎表面抗原水平；核苷/核苷酸类似物。
前言
慢性乙型肝炎病毒感染者抗病毒治疗最新进展的一个重要方面，是要寻找可以预测治疗结局、并可用于优化个体化治疗方案的生物标志物。在慢性HBV携带者，乙型肝炎表面抗原（HBsAg）分别由活化的cccDNA以及整合到宿主基因组的HBV DNA序列转录的mRNA翻译而来。HBsAg既是感染性病毒子的包膜，亦可是无感染性的球状或管状体。病毒活跃复制时，球状或管状体的量远远超过感染性病毒子包膜。无论是自然（非活动携带者）还是抗病毒治疗后控制了病毒复制，仍大量产生这种形式的HBsAg[1-4]。
最近大量研究证实了HBsAg定量分析在抗病毒治疗监测中的临床应用价值[1,5-14]。采用有限疗程聚乙二醇干扰素α治疗HBeAg阳性或阴性慢性乙型肝炎，治疗早期HBsAg水平变化可以预测治疗结束后的持续应答和继后的HBsAg最终清除[1,5～9]。无论是否产生抗-HBs，HBsAg的清除标志着HBV感染的持久控制。
有三种商品化的标化HBsAg水平定量分析试剂盒可供使用：分别是雅培诊断—Architect?、罗氏诊断—Elecsys?和Cobas?，以及意大利索灵—Liaison?，它们均已在欧盟获批临床应用，在美国仅用于研究。这些诊断试验价廉易行，在自动化平台上可高通量检测。藉此，HBsAg定量分析可简便地用于慢性HBV感染者抗病毒治疗中的监测。
使用核苷或核苷酸类似物治疗慢性乙型肝炎，旨在抑制病毒复制酶—HBV DNA多聚酶的反转录功能，以降低病毒的产生。核苷类药物不直接影响HBsAg的转录和翻译过程。鉴于恩替卡韦和替诺福韦抑制反转录酶的作用很强，且具有高耐药基因屏障，一些最新肝病学会的指南，推荐这两种药物为有使用核苷/核苷类似物适应证的慢性乙型肝炎患者的一线治疗药物。恩替卡韦或替诺福韦可使绝大多数慢性乙型肝炎患者获得HBV复制的持久抑制[17～19]。因此，在一些地区，在获准恩替卡韦和/或替诺福韦为医疗保险用药后，将许多初始使用其他核苷类药物治疗的患者，转换为含有这两种药物的抗病毒治疗方案。
有关核苷/核苷酸类似物治疗中HBsAg动力学的资料有限[5,10-14,18,20-25]。有限的这些研究结果显示，核苷/核苷酸类似物治疗后HBsAg水平总体下降者较少见，发生HBsAg清除似比以聚乙二醇干扰素α为基础治疗方案者少。不过这一现象也可能是抗病毒药物的适应证不同而导致的偏倚。干扰素通常用于低HBV DNA载量和高丙氨酸氨基转移酶水平的亚组人群，这些人群更易清除HBsAg。
本研究旨在评估慢乙肝患者生存期内，能否有望接受有限疗程的核苷/核苷酸类似物治疗。为此，我们对接受多个不同核苷/核苷酸类似物序贯治疗、HBV DNA维持在不可测水平的慢性乙型肝炎患者进行了长期的血清HBsAg水平动力学评估，以评价HBsAg定量分析在核苷类药物优化治疗中的临床价值。
患者和方法
患者
本研究是HBsAg水平的纵向分析。前瞻性地采集了1996年12月至2006年12月间在本研究所肝脏病学和胃肠病学部接受诊治的、经组织学确诊的30例慢性乙型肝炎患者的血清标本。入组时所有患者HBsAg阳性、抗-HBs阴性。根据药物在当地先后获批的情况和治疗效果，患者采用了多个不同核苷/核苷酸类似物的治疗方案。入选标准包括治疗过程中至少随访4年，而且保留有可供HBsAg定量分析的血清标本。在本研究机构随访的符合上述标准的患者均被纳入。根据基因型分布，接受随访的所有HBV感染者具有本地区的代表性（见表1）。采自2000年4月至2010年12月间（无2000前的标本）可用的系列血清标本总共有604份（每位患者10～20份标本，平均20.1±7.4份）。研究遵循GCP原则并得到当地伦理委员会批准；患者填写了知情同意书。每日药物使用剂量为：拉米夫定100mg；阿德福韦酯10mg；恩替卡韦0.5mg或1.0mg；延胡索酸替诺福韦酯300mg。
实验室检测
实时定量PCR（COBAS Ampliprep/COBAS Taqman）检测血清HBV DNA水平，量值以IU/mL表示，最低检测限为20IU/mL。
血清经过1:100稀释后，采用Architect技术定量检测HBsAg水平。定量范围为0.05～250.0IU/mL（-1.3～2.4log10IU/mL）。根据试剂盒操作说明书，HBsAg低于0.05 IU/mL者，血清标本不作稀释重新检测；对于1:100稀释后仍大于250.0IU/mL的血清标本，则进一步稀释至最终稀释倍数为1:999后复测。
应用商品化酶免疫分析试剂盒检测HBeAg和抗-HBe。抗HDV抗体亦采取酶免疫分析法。基本核心启动子以及前核心区变异的筛检：根据操作说明书，先采用巢式PCR进行扩增，然后用线性探针杂交分析法检测相应的基因组区段。
采用直接测序法测定HBsAg编码基因与HBV反转录酶B和C亚结构域相重叠部分的基因序列，对所有患者作病毒基因分型。序列测定后作系统进化分析。简述之：采用试剂盒从200μL血清中抽提病毒DNA，根据文献介绍的方法[27～29]，采用引物POL-1、 POL-2和HBPr-94作半巢式PCR，扩增的产物片段长492bp，根据试剂盒供应商提供的说明书对PCR产物进作测序分析。应用野生型HBV A到H基因型的不同序列，采用软件包（3.65版Phylogeny Inference Package，PHYLIP）进行系统进化分析。
统计学分析
统计分析采用Stata 10.0软件。假定HBsAg滴度呈对数正态分布，将HBV DNA达到不可测的第一份血清标本作为起始点，用线性回归法测算病例特异性的HBsAg下降斜率，并据此预测HBsAg达到不可测的时间（无论HBsAg水平下降值是否具有统计学意义）。用中位数来表述样本达到HBsAg不可测的时间分布；用第1和第3四分位数（四分位数间隔，IQR）描述离散度的特征。另外，用一种随机系数混合线性模型，测算群体水平的均差和标准差，同样地以此测算HBsAg达到不可测水平的时间。
结果
患者特征
表1为每位患者的人口学、病毒学和组织学资料。男性24例，女性6例，平均年龄为55.6±10.1岁（范围：30.6～88.1）。其中16例为高加索人、6例为亚洲人、8例为非洲人。18例(60.0%)为HBeAg阴性慢性乙型肝炎。治疗前HBeAg阳性的12名患者中，在进入本研究前，6例仍为HBeAg阳性；在随访期间，3例发生了HBeAg血清转换，HBV DNA同时阴转。
28例患者病毒分型成功，其中9例为A型，B、C、D、E、F和G型分别为6、1、4、5、1和2例。未成功分型的2例中，1例血清标本中的HBV DNA水平不超过2个对数值（log10），另1例尽管PCR扩增成功，但仍无法确定基因型。30例中25例（83.3%）有显著的肝纤维化（MATAVIR分级≥F2），13例为代偿期肝硬化（F4）。无合并HDV感染者（见表1）。
核苷/核苷酸类似物治疗及病毒学应答
平均随访时间为102个月，即8.5年（IQR：88～119个月）。30例患者采用了方案各异的核苷/核苷酸类似物规范治疗。图1和附图1显示患者各自序贯治疗方案的历史记录。总的来说，患者被成功地将原治疗方案转换为更强和/或更高耐药基因屏障的药物，即由拉米夫定转换为拉米夫定加阿德福韦，然后改为单用恩替卡韦或联合替诺福韦。随访结束时，5例患者单用恩替卡韦（中位疗程：32个月；IQR：19～33个月）；1例单用替诺福韦12个月；11例采用拉米夫定联合替诺福韦治疗（该方案的中位疗程为15个月；IQR为12～20个月）；1例为恩替卡韦加阿德福韦治疗18个月；10例采用恩替卡韦加替诺福韦治疗（该方案的中位治疗时间为29个月；IQR为13～42个月）；2例分别单用拉米夫定和阿德福韦治疗72个月和102个月。所有30名受治者血清HBV DNA均达到不可测水平（<20IU/mL），达到HBV DNA不可测的中位时间为47个月（IQR为24～77个月）。
核苷/核苷酸类似物治疗中HBsAg水平的长期动力
监测30例患者HBsAg水平的中位时间为102个月，即8.5年（IQR为88～119个月）。采用线性回归为每例患者的HBsAg水平建立数学模型，分别计算HBV DNA可测阶段和不可测阶段的斜率和截距。每个病例的具体数据见表2（斜率和截距）和副表1（不同治疗方案HBVDNA和HBsAg水平的动力学数据）。图1有选择地了显示了部分患者的随访数据。
由图1及其附图1可见，血清HBV DNA与HBsAg水平动力学不呈平行关系。在整个随访期间，30个病例中的27例，其 HBsAg水平的持续缓慢下降与抗病毒治疗相关（表2中的病例1～27），HBsAg水平下降的斜率范围为从-0.072到0.002，年下降均值为-0.138±0.171log10/年（-0.870～-0.020）。随访期间，27中仅1例（病例12）HBsAg在HBV DNA不可测后29个月消失，该病例在HBV DNA不可测阶段，有更快速的HBsAg下降斜率（表2）。其他26例HBsAg在整个随访期间均未消失，每年HBsAg缓慢下降（平均值为-0.110±0.09log10（原文在log之后无10，译者注）IU/年，范围从-0.419到-0.020）。
HBV耐药导致的病学突破对HBsAg动力学的影响
30例中，7例初始拉米夫定联合阿德福韦治疗（病例8、9、11、15、21、23和25）；20例初始为拉米夫定单用，后因抗病毒治疗失败而加用阿德福韦，其中3例（病例5、7和13）因随访时已经开始联合治疗，因此无拉米夫定单用期间的连续性数据（图1）。如表1示，拉米夫定单药治疗发生病毒学突破时，病毒基因序列分析结果显示，5例（病例4、12、24、26和30）为野生流行株；13例为耐药变异流行株（2、3、6、10、14、16～20、22、28及29）；另有2例无序列测定数据（病例1和27）。在这13例中，12例为耐药变异株导致的治疗失败，其在发生病毒学突破时HBsAg水平短暂轻度上升，所有病例加用阿德福韦后，斜率得到矫正（图1）。其他病例病毒学突破时的HBsAg数据缺失。
HBsAg水平下降模式
22名患者的HBsAg水平下降呈三种模式（病例1～22，见表2和图1）：（1）在HBV DNA可测或不可测阶段均降低（15例，病例1～15）；（2）仅在HBV DNA可测阶段降低（5例，病例16～20）；（3）仅在HBV DNA不可测阶段降低（2例，病例21和22）。在HBV DNA可测和不可测阶段均下降的15例患者中，12例HBsAg水平在HBV DNA可测阶段下降更为明显；另2例（病例1和7）在HBV DNA不可测阶段更明显；还有1例（病例6）的下降水平在两个阶段相同。27例中的另外5例中，3例（病例23～25）在HBV DNA不可测阶段、2例（病例26和27）在HBV DNA可测阶段HBsAg水平的动力学数据缺失，因而无法比较HBsAg下降模式。随访中有3名患者在HBV DNA不可测期间发生了HBeAg血清学转换，其中2例（病例2和5）在继后的随访期间HBsAg下降变缓，另1例没有变化（病例20）。
30例患者中的3例（病例28～30）在随访期间血清HBsAg水平轻度上升，其中2例（病例29和30）分别在随访到32个月和80个月时HBV DNA维持在不可测水平；第3例（病例28）在HBV DNA不可测阶段仅有1份可用的血清标本（表2）。
HBsAg清除时间的测算
对随访期间HBsAg持续下降的18例患者，采用统计模型测算出HBV DNA不可测后清除HBsAg所需的时间。其中4例HBeAg阳性，14例HBeAg阴性；HBV DNA不可测时HBsAg平均滴度为3.29±0.49log10IU/mL，平均斜率为-0.007±0.007log10IU/月，即每年平均下降0.084log10IU。斜率与HBsAg水平呈负相关。其他患者未纳入分析测算，其原因分别是：3例在整个随访期间有过HBsAg上升；5例在HBV DNA不可测阶段一度上升；1例在治疗期间HBsAg快速消失；3例仅有一份数据可用而无法作线性回归分析。
计算得清除HBsAg所需的相应中位数年限为52.2年（IQR：30.8～142.7，提示离散度较宽）。治疗方案对这个预测数据没有影响。
讨论
作为HBV DNA定量分析的有益补充手段，HBsAg定量分析最近才被用于HBV感染和抗病毒治疗结局的监测[4,9,11,13]。本研究中我们观察了HBeAg阳性和HBeAg阴性HBV单一感染患者，口服核苷/核苷酸类似物抗病毒治疗后很长时间内的HBsAg动力学特征，并基于数学模型，获得了抗病毒治疗后HBsAg被清除的理论预测时间。
研究结果发现，抗病毒治疗中，绝大多数患者的HBsAg水平在HBV DNA达到不可测后持续下降，但很慢，且与HBV DNA水平的下降不呈平行关系。这一结果不足为奇，因为HBsAg并非HBV复制的标志物，它反映的只是从活性cccDNA以及整合的HBV序列转录后mRNA所翻译的产物下降[31]。HBsAg消失是罕见事件，本研究中仅出现1例，其他所有患者HBsAg水平在HBVDNA可测或不可测阶段均缓慢下降，直到随访结束仍然可测。总的来说（并非总是）HBsAg在HBV DNA可测阶段的下降斜率较陡，及至HBV DNA不可测阶段，下降幅度趋缓。观察到了HBsAg有多个下降模式（见图1中的附图），但因亚组人数少，很难确定能否代表总人群。
本研究缺乏治疗前可供HBsAg定量分析的标本，因此，无法评估启动抗病毒治疗之前HBsAg水平的自然变化，也就无法与治疗后的变化做比较。不过最近有研究发现，在HBeAg阴性、未经治疗的活动性或非活动性慢性乙型肝炎患者，HBsAg水平下降中位数分别为0.041和0.043log10IU/年[32]，比我们观察到的治疗后HBsAg平均下降值（0.084 log10IU/年）小2倍。这个结果与随访初始时的HBsAg定量结果负相关，提示除了少数患者在治疗中快速清除HBsAg外，持续控制病毒复制并不能显著地加快HBsAg自然清除。这一发现与其他研究者证实的、HBsAg水平与HBV DNA复制没有很强关联性的结论一致[1,2,4]。
有趣的是，13名接受拉米夫定治疗后耐药并发生病毒学突破的患者中，有12例患者在HBV DNA上升到峰值时HBsAg也随之轻度上升，一旦加用阿德福韦并在病毒复制再度抑制后又很快下降，这可能只代表了病毒活跃复制中的mRNA翻译所产生的那一小部分HBsAg而已，而大部分HBsAg则来自不依赖于病毒子的cccDNA和整合于宿主细胞基因组中的病毒序列。
抗病毒治疗过程中的HBsAg清除机制不明。本研究观察到，大多数病例HBsAg水平的大幅度下降发生在抗病毒治疗后的HBV DNA可测阶段，这与以下两个相互间无关联性的假设有关：一个是主要与免疫相关的HBsAg清除，即由病毒蛋白引发的特异性免疫应答，清除了含有cccDNA和产生HBsAg的肝细胞。在这一机制下，许多患者HBsAg水平的波动在HBV DNA阳性阶段比HBV DNA阴性阶段大（图1）。这种细小的波动现象既可能是免疫清除的结果，也可能反映了HBV复制的波动。另一个假设基于这样一个事实，即HBV复制得到控制的患者仍持续地分泌大量构成性HBsAg，这些HBsAg来自于非复制活性而转录活跃的cccDNA以及整合到宿主细胞基因组的编码序列。所以，在HBV复制被控制的患者，HBsAg水平非常缓慢而又长期持续的下降，反映了感染肝细胞池的缓慢缩小。事实的确如此，活的感染肝细胞会将cccDNA传递给子代肝细胞。然而，在不产生感染性病毒子的情况下，感染肝细胞自然死亡后，取而代之的未感染肝细胞不再会被重新感染。这可解释HBsAg缓慢下降的现象。
几项研究结果表明，血清HBsAg定量分析对预测抗病毒治疗病毒学应答有应用价值。有报告显示，聚乙二醇干扰素α治疗 HBeAg阳性或HBeAg阴性慢性乙型肝炎过程中，HBsAg定量分析有很高的阴性预测值[1,6～9,33～35]。HBsAg水平监测似有助于在早自治疗后12～24周发现无应答者，并对已获得应答者优化疗程。有人根据治疗中HBsAg水平动态监测结果，对那些聚乙二醇干扰素α治疗无应答的患者，推荐了一些早期停药规则[1,6～8,33,35]。
换个角度看，给使用核苷/核苷酸类似物治疗的患者制定停药规则，可以减轻因终身治疗而带来的负担。只有HBsAg被清除的患者才可以考虑停止使用核苷类药物，但目前尚无资料显示需要巩固治疗多久才能消除HBsAg。所以，HBsAg水平的系列测定，能够为患者提供预测疗程的信息。一项研究显示，采用拉米夫定单药治疗，HBsAg水平下降仅出现于病毒学长期应答者，发生耐拉米夫定者的HBsAg水平没有变化[36]。在最近一项替诺福韦3年抗病毒治疗研究中，仅在HBsAg消失的少数患者出现HBsAg水平的快速降低，其他患者则保持HBsAg高水平[18,30]。另一项研究提示，在获得病毒学应答的患者中，需要中位时间为10.6年的拉米夫定有效治疗HBsAg才有可能消失 [20]。
我们对采用最强效核苷类药物抗病毒治疗方案的患者做长期随访研究，再验证上述预测时间。得到的结论是：清除HBsAg（排除了HBsAg水平没有下降的病例）的中位时间为52.2年（IQR：30.8～142.7）。患者特征的差异以及商品化标化试剂盒（本研究采用）与自建检测技术（其他研究采用）的差异，可解释这种偏倚。我们的研究对象是具有代表性的、近期内由专业性研究中心随访的患者。患者使用了当时可供使用的最好的抗病毒药物，部分患者由于治疗失败或产生耐药转换为更强效和更高耐药屏障的药物。有趣的是，我们的患者最终几乎都转换为恩替卡韦和/或替诺福韦，转换后HBV DNA都达到不可测，且HBsAg下降斜率没有改变。总之，本研究结果提示，绝大多数采用核苷/核苷酸类似物抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者，即使达到了HBV DNA不可测，有限疗程也是无望的。尽管本研究的例数相对较少，但结论毋容置疑，因为我们采集的系列血液标本数很多，且来自很长时间抗病毒治疗的患者；所有统计学分析结果均有显著性差异。
与此前的研究（包括那些精选自单一药物临床试验的患者）相比，本研究纳入的患者群体反映了临床实际情况，所有患者接受了疗效更强和耐药基因屏障更高的序贯抗病毒治疗方案，获得长期抑制病毒复制至今。随访患者的平均时间为8.5年，最长达10年，而此前的研究一般就评估了治疗后2～3年的HBsAg动力学数据[5,10～14,18,20～25]。我们采用数学模型计算清除HBsAg的平均年限。这个独到的研究结果，能使我们得出这样的结论：核苷/核苷酸类似物抗病毒治疗必须持续终身。这是一个被普遍接受但又未得到公开证实的假设。
结论：本研究建立在对强效核苷/核苷酸类似物治疗慢性乙型肝炎患者很长期时间随访的基础之上。结果显示，如果患者在HBV复制得到很好控制后的数月内HBsAg尚未消失，那么将终身不能清除HBsAg。因此，绝大多数HBV感染者需要终身抗病毒治疗。不过，HBsAg水平监测有助于发现在长期治疗中能够清除HBsAg的极少数患者。HBsAg清除后还需要继续治疗多久才能预防感染复发尚不得而知。
（缪晓辉译校）
点 评
上海第二军医大学长征医院感染科 缪晓辉
在2012年版《欧洲肝病学会临床实践指南：慢性乙型肝炎病毒感染的管理》中，将慢性乙型肝炎治疗终点分为理想治疗终点、满意治疗终点和次满意治疗终点。其中有关“理想治疗终点”的具体描述如下：HBeAg阳性和阴性患者在停药后HBsAg持久消失，伴或不伴有抗-HBs血清学转换。这是首次将HBsAg的清除作为治疗终点而提出。
冠以“理想”，意味着达到该终点的难度很大。运用聚乙二醇干扰素α抗乙肝病毒治疗，在理论和实际上均可以在部分患者达到清除HBsAg甚至抗-HBs血清学转换的目的。然而干扰素抗乙肝病毒的机制之一是清除感染肝细胞，如此，细胞核内的cccDNA以及整合到宿主染色体的乙肝病毒基因序列则可能随感染肝细胞一起被清除，因而干扰素疗法被称为“有限疗程”。而核苷类药物的抗病毒机制是抑制肝细胞内的乙肝病毒复制，究竟能否通过核苷类药物长期治疗而彻底清除HBsAg，一直是倍受关注的问题。本研究的主要目的就是要回答这个问题。
作者对采用多种核苷/核苷酸类似物有效方案长期抗病毒治疗的HBeAg阳性和阴性慢乙肝患者，长时间观察其血清HBsAg水平动力学特征，并与HBV DNA水平作对比。在此基础上建立了数学模型，计算出核苷类药物抗病毒治疗后清除HBsAg的中位时间为52.2年！作者还特别指出，HBsAg的产生，不仅来自于HBV感染性颗粒，更多的是来自于cccDNA转录后的翻译产物，以及整合到宿主细胞染色体的HBV序列转录后翻译产物，因此HBsAg的清除与HBV DNA的消失不呈平行关系。作者得出的结论是：核苷类药物抗病毒治疗不可能是有限疗程，而需要终身治疗。
核苷类药物抗病毒治疗有效者，清除HBsAg需要52.2年，这个数据再次给我们以深刻的提示：抗病毒治疗是一个长期的过程，就目前可供使用的核苷/核苷酸类似物抗病毒治疗方案而言，建立终身治疗的理念是有很必要的。
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