【基础研究】姜黄素促进骨骼肌GLUT4转位改善糖尿病大鼠胰岛素抵抗

文章来源：中华内分泌代谢杂志, 2021,37(2) : 143-148

作者：朱艳娟 程静丽 高忠爱 崔晓 李晓晨 常宝成

摘要 

目的

研究姜黄素对STZ诱导糖尿病大鼠骨骼肌胰岛素抵抗的影响及其机制。

方法

雄性SD大鼠腹腔注射STZ诱导糖尿病大鼠模型。成模大鼠分为糖尿病组(DM)，糖尿病＋姜黄素组(DM＋Cur)，糖尿病＋缓冲液对照组(DM＋NC)。以正常SD大鼠为正常对照组(NC)。DM＋Cur组予姜黄素灌胃治疗，DM＋NC组给予等体积缓冲液灌胃。连续给药12周。12周后检测血糖变化，高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验检测外周胰岛素抵抗。实验结束处死大鼠，取骨骼肌提取总蛋白及细胞膜蛋白，Western blot法检测骨骼肌磷酸化PI3K及AKT和总PI3K及AKT水平，检测骨骼肌总GLUT4及细胞膜上GLUT4水平，免疫荧光检测骨骼肌细胞膜上GLUT4水平。多组间的比较采用单因素方差分析，评估PI3K、AKT磷酸化程度及GLUT4向细胞膜转位的变化。

结果

姜黄素治疗组血糖水平低于糖尿病组[(18.67±1.99对24.38±2.88) mmol/L，P<0.05]，胰岛素抵抗较糖尿病组减轻[平均GIR(14.69±0.29对10.25±0.30) mg·kg^-1·min^-1, P<0.01]，胰岛素信号通路中p-PI3K、p-AKT水平升高，GLUT4向细胞膜转位增多。

结论

姜黄素通过激活PI3K/AKT通路，促进GLUT4向细胞膜转位，增加骨骼肌葡萄糖摄取，最终改善胰岛素抵抗。

随着生活水平日益提高，饮食热量升高及运动量减少为特征的现代生活方式导致的能量过剩造成糖尿病的发病率逐年升高。最新的调查结果显示，中国18岁以上成年人的糖尿病患病率为10.9%，糖尿病前期的患病率高达35.7%^[1]。糖尿病及相关并发症不仅严重影响人们生活质量，并且消耗巨大医疗资源，是全球重点关注的社会公共健康问题^[2,3]。因为糖尿病不可根治，且目前治疗糖尿病的西药在发挥控制血糖作用的同时，存在多种不良反应，而中医中药在我国的历史源远流长。糖尿病在历史上被称为'消渴症'，很多中药被用于治疗'消渴症'，直至目前，仍有很多中成药被广泛用于糖尿病的临床治疗中。因此，人们转向对我国传统中药进行深入研究，希望开辟糖尿病治疗的新领域。

姜黄素是从姜科姜黄属植物，如姜黄、郁金、莪术等的根茎中提取出来的一种天然植物多酚，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用^[4,5,6,7]。近年来许多研究包括本研究组既往的研究结果均显示，姜黄素具有降低血糖、血脂、减轻体重、改善胰岛素抵抗等作用，对糖尿病及其并发症的防治具有一定作用，有望应用于糖尿病的临床治疗^{[8,9,10,11,12,13]}。为明确姜黄素降糖、改善胰岛素抵抗的机制，科学家进行了多项细胞实验，研究结果显示，姜黄素通过抑制炎症反应、抑制氧化应激、激活胰岛素信号通路中的关键酶等改善肝细胞、脂肪细胞胰岛素抵抗，改善糖代谢^{[14,15,16,17,18]}。

鉴于既往对姜黄素降糖机制的研究多集中在肝脏及脂肪组织，其对骨骼肌的影响研究较少，因此本实验重点关注姜黄素治疗的糖尿病大鼠骨骼肌中发生的病理变化。本实验采用小剂量STZ诱导2型糖尿病大鼠模型，给予姜黄素干预，观察姜黄素对血糖、胰岛素抵抗的作用，并研究姜黄素改善骨骼肌胰岛素抵抗的分子机制，为姜黄素应用于临床提供理论依据。

材料和方法

一、材料

姜黄素(纯度>98%，美国Sigma公司)，链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)，Trizol(美国Invitrogen公司)。Western Blot所用一抗购自Abcam，二抗购自三箭公司。自发荧光淬灭剂、DAPI购自Servicebio公司，膜蛋白提取试剂盒购于美国Pierce公司。

二、方法

1．糖尿病鼠模型的制备和实验分组：

SPF级健康雄性2月龄Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，购于天津医科大学实验动物中心，体重180～220 g。所有大鼠除实验要求外，均自由饮水、进食。适应性喂养1周后，采用随机数字表法选取8只，作为正常对照组(NC)。其余32只大鼠20：00开始禁食，隔日晨腹腔注射STZ，剂量为50 mg/kg，并恢复饮食。注射48 h后检测血糖，前一日20：00开始禁食，次日晨尾静脉取血测血糖，空腹血糖(FBG)>16.7 mmol/L，且连续保持5天为造模成功。去除死亡及未成模大鼠，成模SD大鼠按照随机数字表法分为3组：糖尿病组(DM)9只，糖尿病＋姜黄素组(DM＋Cur)10只，糖尿病＋缓冲液对照组(DM＋NC)9只。其中DM组无特殊处理，DM＋Cur组每日按体重给予姜黄素60 mg/kg灌胃，DM＋NC组每日按体重给予等体积缓冲液灌胃。以上各组大鼠饲养条件相同，自然昼夜光线照明，室内通风良好(相对湿度40%～70%，室温18℃～22℃)。

2．高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验：

干预喂养12周后进行高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验。试验前禁食12 h，麻醉后固定于鼠板，分离左颈总动脉连接肝素生理盐水输液器，分离右股静脉连接三通管，分别连接装有40 mU/mL的人胰岛素注射液(丹麦诺和诺德公司)和20%葡萄糖注射液的50 mL注射器，并安装微量输液泵控制流速。静置30～60 min后，颈总动脉取血测基础血糖(BBG)。首先以1.67 mU·kg^-1·min^-1速率输入胰岛素，每5 min颈动脉取血测血糖，当血糖低于BBG -0.5 mmol/L时开始输注葡萄糖，从4～6 mg·kg^-1·min^-1开始。每5 min测血糖1次，根据血糖调整葡萄糖输注速率(即葡萄糖输注率，GIR)，使血糖保持在(基础值±0.5) mmol/L，连续3次血糖都在上述范围内，即达到稳态，钳夹形成。试验共进行120 min，记录输葡萄糖后60～120 min时的13次GIR，并计算平均值(GIR_60-120)，以评价胰岛素的敏感性(GIR越低，IR越严重)。

3．血糖及血清胰岛素测定：

血糖检测使用罗氏快速血糖仪，由尾静脉取血，钳夹试验时由颈总动脉取血。将所取血液样本4℃离心后取上清，ELISA法测定血清胰岛素水平。

4．蛋白提取：

(1)总蛋白提取：取适量骨骼肌组织，PBS清洗后加入裂解液，加钢珠于70Hz振荡15 s，重复3次。组织裂解液于4℃ 12 000转/min离心10 min，取上清液加入上样缓冲液，混匀后100℃加热10min。储存于-20℃备用。(2)骨骼肌细胞膜蛋白的提取：使用膜蛋白提取试剂盒，按说明书进行操作，蛋白储存于-80℃冷冻备用。

5．Western blot法检测蛋白表达：

BCA法测定蛋白浓度，每份样本取等量蛋白上样，进行10% SDS-PAGE凝胶电泳，分离蛋白条带。将PVDF膜用甲醇浸泡激活，采用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上。5% TBST脱脂奶粉室温振荡封闭120 min，TBST洗膜，加入蛋白一抗，4℃摇床上孵育过夜。次日TBST洗膜，加入相应二抗，室温孵育60 min。TBST洗膜，用ECL发光液反复均匀淋膜，UVP凝胶成像系统扫描成像。Image J分析软件将目的条带灰度值数字化，与内参条带的比值进行半定量分析。

6．免疫荧光检测GLUT4向细胞膜转位：

骨骼肌石蜡切片脱蜡至水，置于盛满柠檬酸(pH 6.0)抗原修复液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。自然冷却后PBS(pH 7.4)晃动洗涤。切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走)，加入自发荧光淬灭剂5 min，流水冲洗10 min。滴加BSA封闭孵育30 min。轻轻甩掉封闭液，滴加GLUT4一抗并于湿盒内4°C孵育过夜。次日PBS晃动洗涤，切片稍甩干后加二抗并避光室温孵育50 min。去掉二抗后PBS晃动洗涤，稍甩干后滴加DAPI染液，避光室温孵育10 min。再次PBS晃动洗涤，切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。切片于荧光显微镜下观察并采集图像。

三、统计学处理

采用SPSS Statistics 22软件进行数据的统计学分析，符合正态分布的计量资料以Mean±SD表示。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齐的数据采用Bonferroni′s检验，方差不齐的数据采用Dunnett′s检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。统计结果用GraphPad Prism 7.0软件作图。

结果

一、姜黄素干预降低糖尿病鼠血糖水平，升高血胰岛素水平

注射STZ后DM组、DM＋Cur组、DM＋NC组FBG均明显高于NC组(P<0.01，表1)，FINS水平均低于NC组(P<0.01)，且3组间FBG及FINS差异不存在统计学意义(P>0.05)。给予姜黄素治疗12周后，DM＋Cur组FBG低于DM组(P<0.05)，FINS水平较DM组升高(P<0.05)，提示姜黄素干预可以降低血糖，升高胰岛素水平。干预12周后各组之间体重差异无统计学意义(F＝1.805，P＝0.166)。

二、姜黄素改善糖尿病鼠胰岛素抵抗

高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验结果显示：DM组大鼠平均GIR明显低于NC组[(10.25±0.30)对(23.27±0.32) mg·kg^-1·min^-1，P<0.01]，提示存在严重的胰岛素抵抗。给予姜黄素灌胃治疗后，DM＋Cur组大鼠平均GIR水平高于DM组[(14.69±0.29)对(10.25±0.30) mg·kg^-1·min^-1，P<0.01]，DM＋NC组与DM组相比，平均GIR差异无统计学意义[(10.00±0.26)对(10.25±0.30) mg·kg^-1·min^-1，P>0.05]。

三、Western blot结果

1．大鼠骨骼肌胰岛素信号通路关键蛋白的表达：

骨骼肌组织PI3K及AKT蛋白表达水平在各组间没有统计学差异(均P>0.5)，糖尿病组大鼠骨骼肌磷酸化的PI3K及AKT水平较正常对照组明显降低(均P<0.01)，而姜黄素治疗组大鼠骨骼肌磷酸化的PI3K及AKT水平较糖尿病组明显升高(均P<0.05，图1)。

图1  骨骼肌PI3K和AKT磷酸化水平的变化

Fig 1  Changes of phosphorylation levels of PI3K and AKT in skeletal muscle

2．膜GLUT4表达的变化：

骨骼肌组织整体GLUT4蛋白表达水平各组间差异无统计学意义，骨骼肌细胞膜上GLUT4数量在糖尿病组明显下降，姜黄素治疗组膜上GLUT4数量较糖尿病组明显升高，提示GLUT4向细胞膜转位增多(图2)。

图2  骨骼肌细胞GLUT4转位的变化

Fig 2  Changes of GLUT4 translocation in skeletal muscle cells

四、骨骼肌石蜡切片免疫荧光检测结果

GLUT4荧光染色呈现红色荧光，在骨骼肌细胞的胞浆和细胞膜上均有表达。糖尿病组骨骼肌细胞膜上GLUT4染色少，姜黄素治疗组细胞膜上GLUT4染色较糖尿病组增多，荧光强，提示姜黄素促进GLUT4转位到细胞膜上(图3)。

图3  骨骼肌GLUT4免疫荧光检测(×400)

Fig 3  Skeletal muscle GLUT4 immunofluorescence detection(×400)

讨　论

STZ通过胰岛β细胞表面的葡萄糖转运蛋白2转运到细胞内，诱导DNA损伤和氧化应激使胰岛β细胞坏死^[19]。本实验中，腹腔注射STZ后大鼠血糖水平明显升高，说明造模成功。姜黄素是从姜科姜黄属植物的根茎中提取出来的一种天然植物多酚，结构特点是同一分子结构中同时具有酚及β-二酮结构，具有强效的抗氧化活性。近年来多项研究均发现，姜黄素具有降低血糖的作用。Wang等^[14]进行的实验显示，姜黄素通过抑制NF-κB和JNK的活性，增加3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的摄取，进而改善其胰岛素抵抗。在本实验中，给予姜黄素干预后，糖尿病大鼠血糖水平较对照组明显降低，验证了姜黄素的降糖作用。这一结果与既往研究结果一致^[11,12,20]。

2型糖尿病主要病因为外周胰岛素抵抗，胰岛素抵抗的机制十分复杂，可分为受体前、受体和受体后缺陷。胰岛素通过与靶器官细胞膜受体结合，激活下游磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt)通路，促进脂肪和肌肉细胞中葡萄糖转运蛋白(GLUT4)从胞浆转移到细胞膜上，增加葡萄糖摄取^[21]。GLUT4是一种膜蛋白，存在于骨骼肌、心肌和脂肪细胞中，主要贮存于细胞内的囊泡中。胰岛素与受体结合后，激活下游信号分子，促进含有GLUT4的囊泡向细胞外膜移动，囊泡膜与细胞外膜发生融合，将GLUT4转位到细胞外膜上，使之与细胞外的葡萄糖结合并将葡萄糖转运到细胞内。骨骼肌是葡萄糖代谢的重要组织，是胰岛素发挥作用的主要组织之一，骨骼肌中的葡萄糖转运约占整个机体葡萄糖转运的90%，因此，胰岛素与骨骼肌细胞膜受体的结合，结合后信号的传导，GLUT4的数量以及其向细胞膜的转位等，其中每一个环节的异常都可导致胰岛素抵抗的发生，进而造成血糖异常升高。

本实验中，通过钳夹试验，可以发现DM组大鼠平均GIR水平明显低于NC组，外周葡萄糖摄取水平明显降低，提示体内存在明显胰岛素抵抗。而姜黄素组平均GIR水平较DM组升高，提示姜黄素治疗增加外周葡萄糖摄取，改善胰岛素抵抗，进而降低血糖。为了进一步研究姜黄素是否改善了骨骼肌中的胰岛素抵抗，本实验对骨骼肌细胞胰岛素信号通路中关键酶的磷酸化水平及GLUT4转位进行检测。结果显示各组PI3K、AKT及GLUT4水平无明显差异，提示姜黄素未改变相关基因的表达水平。糖尿病组骨骼肌PI3K及AKT磷酸化水平明显降低，GLUT4转位到细胞膜上的数量明显减少。而姜黄素治疗组的PI3K和AKT磷酸化水平较糖尿病组明显升高，且GLUT4转位到细胞膜上的数量明显增加。免疫荧光染色结果可直观看出糖尿病组细胞膜上GLUT4染色水平降低，姜黄素治疗组骨骼肌细胞膜上GLUT4染色水平较糖尿病组升高。这一结果说明姜黄素发挥改善胰岛素抵抗、降低血糖的机制与其提高骨骼肌细胞胰岛素信号通路中关键酶的磷酸化，增加GLUT4向细胞膜的转位密切相关。

综上所述，姜黄素具有改善胰岛素抵抗，降低血糖的作用，机制是通过提高胰岛素与受体结合后的信号传导通路中的关键酶的磷酸化水平，增加GLUT4向细胞膜的转位，增加葡萄糖摄取。姜黄素作为中药，不良反应较少，深入且明确的研究结果可为其应用于胰岛素抵抗、糖尿病等领域提供新的思路和确凿的证据。

参考文献 （略）