苔藓植物组织培养繁殖
苔藓植物是现存陆生植物中重要的类群之一 , 隶属于高等植物中孢子植物 , 全世界约有23000 余种 , 种数仅次于被子植物 苔鲜植物在生态保护中起着重要的作用 , 包括水土保持 、涵养水源 、 营养物 质的循环与贮存和森林更新等方面， 由于苔藓有较多的生物活性物质 , 有些具有抑菌和抗癌作用 , 是有应用开发前景的药用植物资源 , 苔藓植物在园艺 、环境指示等方面也有广泛应用然而 , 在应用开发苔藓植物时 , 必须首先解决培养和繁殖问题本文综述了苔藓组织培养繁殖的材料 、消毒方法 、培养基质 、 添加物和环境影响因素等繁殖技术进展 , 并介绍了其广阔应用前景 , 为进一步推广应用培养技术提供新信息 , 以促进苔藓植物资源的可持续利用。
植物的组织培养首先是以苔藓植物为材料开始的，早在1905 年就已开始此项研究 , 并 预言苔藓植物的组织培养不但可以用到与苔藓相关的植物上 , 也可用到其他高等植物上苔藓植物愈伤组织是1957年由Allsopp从苔类植物的小叶苔（Fossombronia pusilla）和石地钱（Rebouliahemisphaerica）的孢子培养后首次获得 , 并转移到无机盐培养基上分化成正常的叶状体。Ward在1960年首次报道将金发藓 （Polytrichum commune）和波叶仙鹤藓（Atrichum undulatum） 的孢子接在含蔗糖 、乳酪氨基酸 、椰乳的培养基中 , 2个月后产生了愈伤组织块 。根据Ohta和 Hirose的统计 , 截至 1982年 , 人们已先后从5目7科的 15种藓类和4目15种苔类中获得了愈伤组织。1997年Kowalczyk等也报道从苔类的大萼苔（Cephalozia biscupidata） 。诱导形成愈伤组织 , 并且再生出配子体 , 1982年 , 包文美和陈发生直接将地钱（Marchantia polymorpha）的配子体培养在花盆或木箱中 , 观察其生活史中各个阶段的形态结构随后又有人就葫芦藓（Funara hygrometrica） 的孢子在液体或琼胶培养基上的形态发生、白齿泥炭藓（Sphagnumgirgensohnii） 的孢子的培养及其原丝体的发育、以及钙离子浓度对几种喜钙藓类的孢子萌发和原丝体生长的影响等问题进行了研究。
2 常用的培养材料及基质
进行苔藓植物组织培养时 , 可选择苔藓的孢子或新鲜的孢子体 、配子体 、芽抱 、原丝体或生殖器官 ,甚至可以取游离的细胞或原生质体做为材料。1960年Mard报道在小叶苔（Fossombronia）的孢子萌发培养基中加入 的酵母提取液时 , 在无机盐培养基上能够正常发育的孢子形成一个大的直径在5mm以上并且有疣状突起的球状物。 高谦对真鲜亚纲（Bryidae）9个种的孢子萌发和原丝体发育进行了研究 ，赵建成等对河北产的10种藓类植物的孢子萌发和原丝体发育类型进行了初步研究。刘保东经过6组30个对照实验筛选 出波叶仙鹤藓孢子萌发的最佳培养基配方和培养条件. Chopra和Rashid报道了关于丛本藓（Anoectangium）原丝体的培养, Schweend等研究了小立碗藓的芽体进行了培养。吴跃开以尖叶走灯藓（Plagiomnium acutum）为材料进行培养。Taya等对粗裂地钱风兜变种配子体（Marchantia paleacea var. diptera）进行了培养。
苔藓植物很容易在琼脂 、玻璃纤维 、珍珠岩等基质上进行培养Proskauer曾在玻璃皿中铺上蛭石来培养苔藓 , 还可用经过消毒的石英砂来代替蛭石。吴跃开用5种不同的基质来培养尖叶走灯藓 , 结果发现在草木灰土的基质上的生长量最高 。Sokal等用两种不同类型的培养基MS和KN作试验时发现 , 添加的无机元素和维生素类比MS少得多 , 甚至是根本不添加的KN培养基对苔藓的培养最适合。Martin报道 , 对大多数种类的苔藓植物来讲 , 培养基浓度降为原来的10%对于其生长速度和形态几乎没有影响，在培养过程中常添加一些营养物来促进苔藓的生长 , 如酵母提取液 、酪蛋白水解物、椰乳和各种人工化合物 , 在培养基中加人225mg/L尿嚓啶会抑制泥炭藓直立叶状枝的发育。 在MS培养基中添加30%的蔗糖有利于牛角藓（Cratoneuronfilicinum）愈伤组织细胞的培养。在培养喜钙苔藓植物时 , 当培养基中钙离子的浓度达到一定量时它们才能生长良好 。Hohe等对小立碗藓进行了液体培养。Nehira用Knops液体培养基培养叶苔目（Jungermanniales） 植物 。Takami用MSF培养基悬浮培养角苔（Anthoceros punctatus）。 此外 , 还可运用一些生物反应器来进行培养 , 曾用气升式光反应器培养小立碗藓。
3 消毒方法
消毒一般用Clorox（7%，v/v ), 和去垢剂(0.1%,w/v) 处理1min左右 , 然后用消毒的蒸馏水反复冲洗。〕不同的材料消毒的方法也不同 , 如孢子的消毒 将孢蒴剪下 , 装人离心管中 , 加人次氯酸钙的饱和液或5%次氯酸钠水溶液消毒10min, 再用无菌水洗几次。然后用玻璃棒将孢蒴捣碎 , 使孢子放出 , 加人少量无菌水制成孢子悬浮液 , 最后用消毒过的吸管或小喷雾器将孢子在无菌条件下接种到培养基上 Sokal等用酒精对几种藓类的外植体进行消毒 , 而后再用漂白粉饱和液与水1：1 或 混合的消毒液消毒结果发现 , 消毒时间为0.5min时 , 不能有效的杀死细菌 , 而当消毒时间提高到1min时 , 绝大部分外植体都被杀死 , 外植体几乎完全褪色。Saboljevic设置了12个次氯酸钙的浓度对孢子体和配子体进行消毒 , 发现当浓度为12%是孢子体的存活率最好 , 而配子体则在浓度为9.0%时最好。李文安在对地钱进行消毒时使用的消毒剂为漂白精 , 浓度为3% , 消毒时间为 5一10min , 其成活率提高到约50%左右。
4 组织培养的影响因素
4.1 植物激素
细胞分裂素 6一BA 和KT促进葫芦藓芽的形成 , 而氯丙嚓抑制受其诱导的芽的形成。曾有报道用不同的植物激素诱导牛角藓的愈伤组织 , CA3和2，4-D的 诱导效果较好。IAA，GA3对苔藓的原丝体和蒴柄的生长有促进效果。培养梨蒴立碗藓次原丝体时 , 添加细胞分裂素可促使无性繁殖 。RANI报道 , 浓度为 0.01‰mol·ml GA。 最适合刺激小珠藓 。 形成配子囊Sokal等报道 , 生长调节物质在愈伤组织的诱导中作用十分明显 , 在MS培养基中添加1mg?100ml 2，4-D和KT很快就能形成愈伤组织。Selkirk在培养钱苔 。的试验中发现 ,2，4-D , 浓度为0.01mg?0.1ml 时叶状体在培养液的表面微微翘起 当浓度为1mg?0.1ml时时 , 叶状体变得十分平直；浓度达到10mg?0.1ml时， 形成小的 、具有很多分枝的莲座状的外形 , 并且端部卷曲人培养液底部。
4.2 温度
一般说来 , 极地和温带地区苔藓植物的光合最适温度为5-20 ℃。而葫芦藓的配子囊只有在植物体处于温 度为 7℃ 中才能形成。 连续光照条件下培养尖叶拟船叶藓（Dolichomitriopsis diversiformis） ，20℃的。的原丝体生最快 、分枝最早。异毛藓（Anisothecium）、 丛本藓和丝瓜藓（Pohlia）放在3500lx持续光照和温度为12，25，30 ℃ 3种温度下培养 , 结果异毛藓的原丝体在25 ℃时生长良好 , 两种组织的发育也很好 , 原丝体呈绿色 , 分枝很多 , 培养15d后形成芽的数目最多 , 平均芽长度5.0mm。丝瓜藓原丝体的生长随温度的升高而减缓 , 芽在所有的温度中都能形成 , 以25 ℃为最适 。
4.3 光照
苔藓植物属于阴生植物 , 一般比其他高等植物需要的光照度低 。Vashistha用5个光照度分别是700，1100，2200，3500和4500lx，在25 ℃左右培养几种苔藓。结果光照度达到3500lx 时全部原丝体开始生长 , 原丝体呈深绿色 , 分枝较多 , 气生组织和匍匐组织发育较好 , 3500lx光照度下 的芽数最多 丝瓜藓原丝体的培养也呈现出类似的情况而泥炭藓和其他藓类在 8000lx的光照度下光合作用并不显示出饱和现象。Chopra在25 ℃左右培养真藓 , 在 1800-2000lx 时增长的生物量最高。在 20℃环境下培养尖叶拟船叶藓孢子 , 24h光照4d的孢子萌发率达83.3%。在光照条件下黄丝瓜藓。 的原丝体本身形成的特殊形态分化物质反过来可促使其本身的形成 , 白色光照下也可促进芽的形成 , 红光效果最佳 , 蓝光对植株的生长效果最好 , 但不形成芽 , 绿光最不利于生长 。
4.4 pH值
张朝晖等报道短柄紫背苔（Plagiochasma sessillicephalum）孢子萌发 的 值范围是 6-10, 直叶珠藓（Bartramia ithyphylla）pH 值范围是5-10, 反纽藓（Timmiella anomala）pH 值范围是6-10.贵州黄果树喀斯特区域和云台山喀斯特林区生长的苔藓植物表现出能适应中性或碱性环境如葫芦藓暖地变种（Funaria hygrometrica Hedw.var.calveacens) 的最适pH值为8,细枝赤齿藓圆条变种的最适pH值为8 , 反纽藓的的最适pH值为9, 尖叶扭口藓的最适pH值为7, 而在较酸环境条件下 （如短柄紫背苔pH值＜4 , 反纽藓pH值＜6 , 直叶珠藓pH值＜5）孢子则不能正常萌发。
4.5 水分和湿度
研究表明 , 大羽藓（Thuidium cymbifolium） 和垂藓（Chrysocladium retrorsum） 在水分含量为70%-80%时生长良好 ；湿地葡灯藓（Plagiomnium aculum） 在水分含量为80%-90% 时长势良好。在相对湿度大于90% 的环境条件下 , 每日2500lx 日光 , 光照14h 能使波叶仙鹤藓孢子萌发的最好。
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