Multiqc（转录组分析之质量评估）

fastqc是一款基于java的软件，能够对测序数据的质量进行评估。一个样本生成一个报告，当样本量过多时，逐一查看样本质量就稍显不方便，multiqc是一个基于Python的模块, 用于整合其它软件的报告的软件，能将fastqc生成的多个报告整合成一个报告的软件，这样能方便的查看所有测序数据的质量。目前支持以下软件结果的整合：

 Pre-alignment tools

Alignment tools

Post-alignment tools

multiqc的安装：

在已经安装Anaconda的情况下，安装MultiQC非常简单，直接在shell命令面板中输入以下命令：

conda install -c biocondamultiqc

multiqc的使用和常用参数：

Usage: multiqc[OPTIONS] <analysis directory>

 Options:

-f, --force 重写已存在的报告

-s, --fullnames 保留样本名称

-o, --outdir TEXT 报告输出路径

-l, --file-list 提供包含搜索路径列表的文档（每行一个）

-z, --zip-data-dir 压缩数据目录

-p, --export 将报告中的图导出为静态图

  -fp, --flat                    只使用平面图（静态图）

-ip, --interactive 只使用动图(HighCharts Javascript)

--pdf 输出PDF格式的报告（需要安装Pandoc）

现在用最简单的命令整合fastqc的报告：

(multiqc+fastqc结果报告存放路径+multiqc报告输出路径）

> multiqc /data/home/chj/fastqc_result -o/data/home/chj/multiqc_result

命令执行完毕会生成1个html报告，直接网页打开就可以查看和一个multiqc_data的文件夹，其中包含一些数据基本的统计信息和日志文档。

multiqc整合的fastqc的报告包含以下几个部分：

1 General Statistics：所有样本数据基本情况统计

%Dups——重复reads的比例

%GC——GC含量占总碱基的比例，比例越小越好

Length——测序长度

M Seqs——总测序量（单位：millions）

2 Sequence Quality Histograms：每个read各位置碱基的平均测序质量

横坐标——碱基的位置

纵坐标——质量分数

质量分数=-10log10p（p代表错误率），所以当质量分数为40的时候，p就是0.0001。此时说明测序质量非常好。

绿色区间——质量很好，

橙色区间——质量合理。

红色区间——质量不好。

此处可以看出我的4个样本在70个碱基后的测序质量平均线落在红色区间，测序质量不合格。

3 PerSequence Quality Scores 具有平均质量分数的reads的数量

横坐标——平均序列质量分数

纵坐标——reads数

绿色区间——质量很好

橙色区间——质量合理

红色区间——质量不好

当峰值小于27时——warning

当峰值小于20时——fail

由此图中可以看出低质量reads占整体reads的比例（估算各颜色区域曲线下面积）

图中可以看出：4个样本中有1个样本的最高峰值在20左右，低质量read数量占总体reads的比例大概在50%，所以这个样本的测序质量是不合格的。

4 Per Base Sequence Content  ：每个read各位置碱基ATCG的比列

对所有reads的每一个位置，统计ATCG四种碱基的分布，

横坐标——碱基位置，

纵坐标——样本。

%T——红色

%C——蓝色

%A——绿色

%G——紫色

reads每个位置的颜色显示由4种颜色的比例混合而成，哪一个碱基的比例大，则趋近于这个碱基所代表的颜色。

正常情况下每个位置每种碱基出现的概率是相近的。

如果ATGC在任何位置的差值大于10%——warning

如果ATGC在任何位置的差值大于20%——fail

由图中可知：reads的前半部分大概11个bp左右的ATGC含量比例是非常不均匀的，可能有过表达的序列的污染。

5 Per Sequence GC Content ：reads的平均GC含量

横坐标——GC含量百分比

纵坐标——数量

正常的样本的GC含量曲线会趋近于正态分布曲线，曲线形状的偏差往往是由于文库的污染或是部分reads构成的子集有偏差（overrepresented reads）。形状接近正态但偏离理论分布的情况提示我们可能有系统偏差。

偏离理论分布的reads超过15%时——warning

偏离理论分布的reads超过30%时——fail

6 Per Base N Content ：每条reads各位置N碱基含量比例

当测序仪器不能辨别某条reads的某个位置到底是什么碱基时，就会产生“N”，统计N的比率。正常情况下，N值非常小。

横坐标——read中的位置

纵坐标——N的数量比

当任意位置的N的比例超过5%——warning

当任意位置的N的比例超过20%——fail

由图中看出，有两个样本在70bp后的N碱基的含量大幅增加，甚至达到了80%。

7 Sequence Duplication Levels：每个序列的相对重复水平

横坐标：每个序列的相对重复水平

纵坐标：在文库中的比例

当非unique的reads占总数的比例大于20%时——warning

当非unique的reads占总数的比例大于50%时——fail

测序深度越高，越容易产生一定程度的duplication，这是正常的现象，但如果duplication的程度很高，就提示我们可能有bias的存在。

8 Overrepresented sequences：文库中过表达序列的比例

横坐标——过表达序列的比例

纵坐标——样本

过表达序列的比例>0.1%——warning

过表达序列的比例>1%——warning

 一条序列的重复数，因为一个转录组中有非常多的转录本，一条序列再怎么多也不太会占整个转录组的一小部分（比如1%），如果出现这种情况，不是这种转录本巨量表达，就是样品被污染。这个模块列出来大于全部转录组1%的reads序列，但是因为用的是前100,000条reads，所以其实参考意义不大。

9 Adapter Content 接头含量

横坐标——碱基位置

纵坐标——占序列的百分比

>5%——warning

>10%——fail

fastqc帮助我们检测测序数据的质量，具体问题具体分析，后续我们还需要去除接头和质量不好的reads，去污染等操作来进行数据过滤。

参考：

https://www.jianshu.com/p/303de2c95239

https://www.jianshu.com/p/14fd4de54402

https://blog.csdn.net/ada0915/article/details/77201871