以前一直混混沌沌,知道RNA-seq建库测序大概是打断、加接头、PCR、测序这么些步骤,至于具体每步如何操作,最终怎么测得的PEReads;Reads跟原始模板的对应关系,都很模糊。这两天还算清闲,便简单整理整理。
RNA建库步骤1:
总RNA --->polyA富集mRNA ---> 打断 ---> 随机引物反转录成cDNA --->末端修复、加A、加接头(该过程是PCR过程)
此时产物为:?
RNA建库步骤2:
步骤1产物稀释(稀释倍数可能为1000或10000倍,或更少或更多)? ---> cBot 成簇
稀释的目的有2个:
- 减小体系的dup率;
-保证?产物进入cBot时有自己的空间,以利后期成簇;
成簇过程:
测序:
SE测序较为简单:
PE测序则相对复杂:?
从PE测序来看,Read1跟Reads2并非是直接测模板的两端,而是其中一条Reads测的是模板的某一段的互补或反向互补序列。
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