食品实验室服务
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微生物检测技术
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主要内容
➢采样与制样
➢划线、分离和纯化
➢革兰氏染色与显微观察
➢清洗、消毒与灭菌
一、采样与制样
一、采样
1.采样的意义
➢及时掌握食品及原料的过程卫生状况(食品采购、生产加工、储存运输、销售消费等)。
➢评价食品卫生质量。
➢用于寻找及分析问题，制定和实施控制措施。
什么叫采样?
➢采样是指在一定质量或数量的产品中，取一个或多个代表性样品，用于微生物检验的过程；
➢样品必须对取样的整个产品或批量具有代表性；
➢样品的大小应能满足在需要时进行重复分析的需要；
➢样品到达实验室时的状况应能反映出取样时产品的真实情况。
采样标准依据：GB 4789.2-2016 食品微生物学检验 总则
2.采样原则
2.1样品的采集应遵循随机性、代表性的原则。
2.2采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。
3.采样方案
3.1根据检验目的、食品特点、批量、检验方法、微生物的危害程度等确定采样方案。
➢采样方案分为二级和三级采样方案。二级采样方案设有n、c和m值，三级采样方案设有n、c、m和M值。
n:同一批次产品应采集的样品件数;
c:最大可允许超出m值的样品数;
m:微生物指标可接受水平的限量值(三级采样方案)或最高安全限量值(二级采样方案) ;
M:微生物指标的最高安全限量值。
3.2采样方案的选择:
3.2.1 广泛分布于食品中，具有严重危害或者中度健康危害的微生物(病原菌)，如沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠埃希氏菌、肉毒梭菌、单核细胞增生李斯特菌等执行二级计数抽样方案(+/-)。
3.2.2 没有或者具低度危害的微生物(卫生指标菌)，或者具中度危害(扩散限制)的微生物，如需氧微生物、嗜冷微生物、乳酸菌、酵母菌、霉菌(产犊霉菌除外)、大肠菌群、耐热大肠菌群等执行三级计数抽样方案(数值和浓度)。
二级计数抽样方案流程
目标微生物以检出/未检出(+/-) 为指标:
➢设定m值、n值和c值
➢抽取n个子样，组成试验样品
➢检验每个子样
接收条件:所有样品的检验结果≤m;≤c个样品的检验结果>m
拒绝条件: >c个样品的检验结果>m。
例1:乳粉中沙门氏菌标准为为n=5、c=0、 m=0，其中n=5即取样5个，c=0即意味着在该批检样中，未检测到沙门氏菌，则此批货物可被接受。
三级计数抽样方案流程
目标微生物以计数为指标:
➢设定m值、M值、n值和c值
➢抽取n个子样，组成试验样品
➢检验每个子样
接收条件:所有样品的检验结果≤m,≤c个样品的检验结果介于m和M之间
拒绝条件: >c个样品的检验结果介于m和M之间或任一样品的检验结果>M。
例:乳粉的细菌总数标准n=5、c=2、 m=5*104、 M=2*105。 其意义是从一批产品中，取出5个检样:
接收结果: 5个子样的值全<m或允许≤2个检样的菌落数在m和m值之间。
拒绝结果:如果有3个以上检样的菌落数是在m和M值之间或1个检样菌落数超过M值者。
ICMSF推荐的随机抽样方案
➢国际食品微生物标准委员会( ICMSF)所建议的随机取样方案是目前世界各国最为流行的取样方案，为ICMSF推荐的取样方案。ICMSF提出的基本取样原则是根据:
各种微生物本身对人的危害程度各有不同。
涉及健康危害水平的抽样方案及其应用条件ICMSF
危害类型
目标微生物实例
抽样后食品被处置和消费的条件
降低危害
危害无变化
增加危害
无直接健康危害
菌落总数
三级法，n=5,c=3
三级法，n=5,c=2
三级法，n=5,c=1
轻度间接危害(指示菌）
大肠菌群、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌
三级法，n=5,c=3
三级法，n=5,c=2
三级法，n=5,c=1
中度危害，有限的扩散
金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、产气荚膜梭菌
三级法， n=5,c=2
三级法，n=5,c=1
三级法，n=10,c=1
重度危害，通常不威胁生命，后遗症少见，或病程中等
沙门氏菌、副溶血性弧菌、致病性大肠杆菌
三级法， n=5,c=0
三级法，n=10,c=0
三级法，n=20,c=0
重度危害，对一般人群或特定人群危胁生命或导致后遗症或秉承较长
肉毒梭菌、霍乱弧菌、伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌
三级法，n=15,c=0
三级法，n=30,c=0
三级法，n=60,c=0
二级和三级方案对比
➢从标准的严格程度看，二级取样方案比三级取样方案要求更严格。
➢二级取样方案的合格判定标准只有“是”和“否”，没有中间带，而三级取样方案则有中间带，相对宽松，这也表明三级取样方案更注重各种微生物本身对人的危害程度.从风险评估的角度看，也更科学一些。
➢从标准的制定来看，三级取样方案判定合格标准的制定更需建立在科学评估的基础上，手续更加繁琐，而且在实际应用中操作较复杂;而二级取样方案在实际操作中则相对简单。
3.2.2采样器具要求:
➢对取样工具和一些试剂材料应提前准备、灭菌
➢开启容器的工具:双层纸包裹灭菌(121℃，15min) 后，通常可在干燥洁净的环境中保存2个月。超过2个月后要重新灭菌。
➢特殊样品采用适当工具。
➢取样容器:采用密封容器，最好不要使用玻璃容器，因为其在运输途中易破碎而造成取样失败。
➢温度计、标记工具、防护用品等。
3.3各类食品的采样方法
3.3.1预包装食品
3.3.1.1应采集相同批次、独立包装、适量件数的食品样品，每件样品的采样量应满足微生物指标检验的要求。
3.3.1.2独立包装小于、等于1000g的固态食品或小于、等于1000mL的液态食品，取相同批次的包装。
3.3.1.3独立包装大于1000 mL的液态食品，应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体，使其达到均质后采集适量样品，放入同一个无菌采样容器内作为一件食品样品;大于1000g的固态食品，应用无菌采样器从同一包装的不同部位分别采取适量样品，放入同-一个 无菌采样容器内作为一件食品样品。
3.3.2散装食品或现场制作食品
用无菌采样工具从n个不同部位现场采集样品，放入n个无菌采样容器内作为n件食品样品。每件样品的采样量应满足微生物指标检验单位的要求。
3.4采集样品的标记
应对采集的样品进行及时、准确的记录和标记，内容包括采样人、采样地点、时间、样品名称、来源、批号、数量、保存条件等信息。
3.5采集样品的贮存和运输
3.5.1应尽快将样品送往实验室检验。
3.5.2应在运输过程中保持样品完整。
3.5.3应在接近原有贮存温度条件下贮存样品，或采取必要措施防止样品中微生物数量的变化。
二、制样
制样的一般要求:
➢全部制备过程应为无菌操作
➢冷冻样品应在规定温度和时间下缓化
➢制样应充分均匀:
液体样品振摇混匀;粉末状的边取边混;固体样品应从不同部位取样，兼顾表面和深度。
➢取好的样品应以适宜方式与稀释液充分混匀
➢尽量去除产品中可能存在的影响微生物指标检测的因素。
二、接种、分离与纯化
➢划线接种:这是最常用的接种方法。
即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。
划线的目的是为了获得单菌落，以便观察菌落特征和挑菌纯化鉴定。
划线方式很多，例如三区划线，四区划线等。
➢纯化
如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养(Pure culturte)。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为纯化。
目的:得到更多的纯培养物，同时细胞活性更好，利于生化鉴定。
注意事项:必须挑去一个单独的可疑菌落，并且外观(大小、形态)相同情况下，也并不代表是同一种菌。
三、革兰氏染色与显微观察
细菌是一类比真菌更小的微生物，必须通过光学显微镜的油镜或者电子显微镜观察。
➢革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，这种染色法是由一位丹麦医生汉斯.克里斯蒂安革兰( Hans Christian Gram，1853年- 1938年)于1884年所发明。
➢未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。
1、革兰氏染色的原理
通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色(实为紫中带红) ;
革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
染色的差异主要是由于阴性与阳性细菌细胞壁的差异所引起的
2、革兰氏染色的步骤
1)涂片固定；
2)初染:结晶紫染1分钟，水洗；
3)媒染:加碘液覆盖涂面染约1分钟，水洗，用吸水纸吸去水分。
4)脱色:加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色约15-30秒，直至染色液被洗掉，不要过分脱色。水洗。
5)复染:加蕃红染色液，染1分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。
3、细菌的显微镜检
1）当光线通过玻片与镜头之间空气时，由于两者密度不同，光线发生折射，降低了视野的照明度。
2）若中间加入香柏油或液体石蜡，其折光率与玻片相近，则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更清晰。
3.1油镜使用与涂片观察
所需材料
-普通光学显微镜
-香柏油或液体石蜡
-载玻片
显微镜观察
①调光
②低倍镜观察
③高倍镜观察
④油镜观察
移开高倍镜→滴加香柏油/液体石蜡→ 转换油镜，镜头浸入油中→微调细准焦螺旋观察物象。
常见细菌革兰氏染色片:
混合菌涂片:革兰氏阴阳菌颜色对比明显说明染色技术完全掌握
四、清洗、消毒与灭菌
消毒(disinfection) :杀灭或清除传播媒介上病原微生物，使其达到无害化的处理。
灭菌(sterilization) :杀灭或清除传播媒介上一切微生物的处理。
一、无菌室消毒
无菌室消毒一一依据GB/T 27405-2008
1、紫外线消毒
1.1 在室温20℃-25℃时220V30W紫外灯下方垂直位置1.0m处的253.7 nm紫外线辐射强度应≥70 μW/cm2,低于此值时应更换。适当数量的紫外灯,确保平均每立方米应不少于1.5W。
1.2 紫外线消毒时,无菌室内应保持清洁干燥。
1.3 在无人条件下,可采取紫外线消毒,作用时间应≥30 min。室内温度<20℃或>40℃、相对湿度大于60%时,应适当廷长照射时间。
1.4用紫外线消毒物品表面时,应使照射表面受到紫外线的直接照射,且应达到足够的照射剂量。
1.5 人员在关闭紫外灯至少30min后方可入内作业。
紫外线辐照能量低，穿透力弱，仅能杀灭直接照射到的微生物，因此消毒时必须使消毒部位充分暴露于紫外线。
照射剂量和时间:不同种类的微生物对紫外线的敏感性不同，用紫外线消毒时必须使用照射剂量达到杀灭目标微生物所需的照射剂量
2、臭氧消毒
2.1封闭无菌室内,无人条件下,采用20mg/m3浓度的臭氧,作用时间应≥30 min.消毒后室内臭氧浓度≤0.2 mg/m3时方可入内作业。
2.2按照GB/T 18202的规定,检测室内臭氧的浓度。
臭氧是一种广谱杀菌剂，可用于水、物品表面和空气消毒。
臭氧为强氧化剂，对多种物品有损坏，浓度越高对物品损害越重，可使铜片出现绿色锈斑、橡胶老化，变色，弹性降低，使织物漂白褪色等。使用时应注意。
3、乳酸熏蒸消毒法
一般常规消毒，即每100m3空间用乳酸12mL，加等量水后加热蒸发30分钟(如:酒精灯加热、电炉加热等)，熏蒸完毕后继续密闭门窗6小时。室内相对湿度60%时，杀灭效果最好。
乳酸主要通过使菌体蛋白变性凝固而达到杀菌作用。能达到消毒效果，但腐蚀性强，室内用品易受损伤，还有刺激性气味,气体的扩散力弱。
臭氧消毒与乳酸消毒对室内空气消毒的效果探讨（2003）
无菌室空气灭菌效果检测方法沉降法
1.无菌室空气灭菌效果验证方法(沉降法)
1.1 在消毒处理后与开展检验活动之前期间采样。
1.2 取样位点的选择应基于人员流量情况和做试验的频率。一般情况下,无菌室面积≤30m2时,从所设定的一条对角线上选取3点，即中心1点,两端各距墙1m处各取1点；无菌室面积≥30m2时,选取东、南、西、北、中5点,其中东点、南点、西点、北点均距墙1m。
1.3 在所选位点,将平板计数琼脂平板(90mm)置于距地面80cm处,开盖暴露15 min,然后,置于36℃土1℃恒温箱培养48士1h.如果检查某目标菌，则可用选择性琼脂平板(如PDA平板)。
◆室内若面积≤30m2,在对角线上选取3点；若≥30m2，选取东、南、西、北、中5点，以上除中心点外，其余点均须距墙1m。
◆在所选点放置PCA平板，需距离地面80cm处，开盖暴露15min, 36℃土 1℃,48h土1h。
◆若检测霉菌、酵母菌，可使用PDA平板，相应温度和时间培养。
二、培养基和试剂灭菌
灭菌方式:高压灭菌、煮沸灭菌、过滤除菌等。
注意避免过度加热:
1.大容积(>1000mL)时容易过度加热；
2.放置物品太多或灭菌后未及时冷却。
平皿、工器具灭菌和设备消毒一依据GB/T 27405-2008
器具和设备
湿热灭菌:采用高压灭菌器,121℃灭菌20 min,适用于玻璃器皿、移液器吸头、塑料瓶等。
干热灭菌:采用干燥箱灭菌,160℃灭菌2h,180℃灭菌1h,适用于玻璃器,不锈钢器具等。
液体消毒剂消毒:使用适当浓度的自配或商业液体消毒剂(参见表D.1)对工作台面、器具或设备表面进行消毒。可按照GB 15981的规定;评价自配或商业消毒剂的消毒效果;可按照ISO 18593,监测工作台面。器具或设备表面的酒毒效果。
➢干热灭菌法是利用干热灭菌器内的高热空气对流与介质传导进行灭菌。
适用:耐高热，不耐湿的物品，主要用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。
一般细菌的繁殖体，在干燥状态80～100℃经1小时可以被杀死，芽孢则需要160℃经2小时杀灭。
➢湿热灭菌法是利用饱和蒸汽的湿热在一定压力下所释放的潜热杀灭病原微生物、细菌繁殖体、芽胞和病毒的方法。
适用:耐高温、耐高湿的器械和物品的灭菌，如金属器皿、玻璃器皿、基础培养基等。
根据消毒剂对微生物的杀菌能力，可将消毒剂分为三类：
高效消毒剂:二氧化氯、双氧水、戊二醛、次氯酸钠(84消毒液)等；
中效消毒剂:有乙醇、碘伏等；
低效消毒剂:有洗必泰、新洁尔灭等。
酒精擦手前与酒精擦手后
◆紫外线表面消毒与液体消毒剂消毒效果及其评价方法，请参照《GB 15981-1995 消毒与灭菌效果的评价方法与标准》。
◆高压锅灭菌效果评价方法:
化学指示卡:使用方便，高压后可立即得知监测结果
生物指示剂:准确性高
压力灭菌指示胶带:
以医用美纹纸为基材，涂以变色油墨作灭菌指示剂，背涂以压敏胶而成。专用于粘贴在待灭菌物品包外，用于标示该物品包是否已经过压力蒸汽灭菌处理过程，以防与未经灭菌下理的物品包相混。
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