人类白细胞抗原（HLA）的特点及检测方法

HLA基本概念及研究历史

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▲△MHC是脊椎动物体内最复杂且具有高度多态性的基因群；MHC抗原位于有核细胞表面，对抗原递呈和免疫信号传递起关键作用，能引起快而强的排斥反应。不同种类哺乳动物MHC及其编码产物的名称各异，小鼠的MHC称为H-2复合体，而人类的MHC通常称为HLA基因或HLA复合体。

HLA是首先在白细胞上发现的人类的MHC抗原；是异基因造血干细胞移植中判断供、受者组织相容性匹配度的最重要的基因编码产物，其高度的多肽性影响着细胞和器官移植的免疫反应，是影响移植存活率的重要因素之一。

在同种不同个体之间进行细胞、组织或器官移植，如果移植物不能被受者接受，则发生宿主排斥移植物或移植物抗宿主反应，移植便有可能失败。前者称为“宿主抗移植物反应（HVGR）”；后者称为“移植物抗宿主反应（GVHD）”。

HLA的命名及结构

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▲△按照世界卫生组织HLA系统命名委员会2010年公布的等位基因命名原则，一个完整的HLA等位基因由8个数字和1个字母组成。如HLA - DRB1 * 24:02:01:02 L，其中“A”代表基因座位，“24”代表对应的血清学特异性，“02”代表编码区碱基取代并且氨基酸改变，“01”代表编码区碱基取代但氨基酸不变，第二个“02”代表内含子或非编码区碱基取代，最后的字母表示基因的表达状态（“L”代表该等位基因低表达，“N”表示该等位基因不表达，“S”表示该基因编码可溶性的分泌型蛋白，“C”表示该等位基因编码的产物存在于胞浆中，“A”表示异常表达的等位基因，“Q”表示有疑问而不能断定）。

HLA-I是细胞膜糖蛋白，由一条（重链）α链和一条（轻链）β2微球蛋白组成，重链分为胞浆区，跨膜区，胞外活性区（免疫球蛋白样区，肽结合区）。HLA-II是膜糖蛋白，由一条a多肽链和一条β多肽链组成。

HLA的功能及应用 

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▲△HLAⅠ类分子广泛分布于有核细胞表面（而成熟的红细胞、神经细胞及滋养层细胞不表达），与Tc细胞（细胞毒性T细胞）表面CD8分子结合，呈递内源性抗原。HLAⅡ类分子分布于抗原提呈细胞（单核/巨噬细胞，成熟B细胞，树突状细胞）和活化T细胞表面，与Th细胞（辅助性T细胞）表面CD4分子结合，呈递外源性抗原。

HLA位于人类细胞表面，参与人体的免疫应答反应，与骨髓移植中移植物抗宿主反应相关。同时，许多报道指出，HLA也是疾病相关的遗传标记物之一，与一些感染性疾病、母婴免疫反应和肿瘤等疾病的进程有关。此外，HLA复合体具有高度的多肽性，在无关个体间HLA表型完全相同的几率极低，故HLA复合体被看作是伴随个体终生的特异性遗传标记。

应用于：器官、骨髓移植检测、亲子鉴定、法医鉴定

常见的HLA的基因分型检测方法

常见的HLA基因分型检测方法有以下4种：

1. PCR-SSP 序列特异性引物（PCR with Sequence specific primers)

2. PCR-SSOP序列特异性寡核苷酸探针杂交（PCR with Sequence specific oligonucleotide probes）
   

3. SBT 以一代测序为基础的分型（Sequencing based typing）

4. NGS 以二代测序为基础的分型（Next-Generation Sequencing based typing） 

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PCR-SSP

PCR-SSP方法主要应用于配型的低分辨基因分型检测，此方法使用一整套等位基因特异性引物对样本HLA-A、B、DR三个等位基因进行PCR扩增，然后根据扩增产物的有无，来判断待测标本的HLA型别。

缺点：不能检测出新的等位基因

优点：流程简单易操作、耗时短

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PCR-SSOP

流式荧光微球反向SSO分型方法，DNA经PCR扩增之后，与SSO探针杂交，通过观察杂交发生与否，来判断待测标本的HLA型别。应用于中、高分辨基因分型检测。

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包被了探针的微球

缺点：无法检测新的等位基因

优点：灵敏度高、特异性强、样本需求量少

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PCR-SBT

• 以一代测序为基础的HLA分型方法

• Sanger测序（双脱氧链ddNTP末端终止测序法）

• 每一个碱基的读取准确率高达99.99%

• HLA分型“金标准”

优点：灵敏度高；可以直观的读取等位基因DNA序列，检测出新的等位基因

缺点：耗时长、通量低，会出现模棱两可的结果

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PCR-NGS

NGS又叫高通量测序，目前已应用于高分辨基因分型检测。

优点：灵敏度高、特异性强、通量高、样本需求量少、不会出现模棱两可的结果

缺点：耗时长、成本高

实验流程

目前在实验室中进行HLA检测主要采取PCR-SBT方法，实验流程如下：▼

PCR-SBT方法是双等位基因测序，出现模棱两可的结果是该方法固有的缺陷。模棱两可的基因型结果是指在HLA基因分型过程中，标本指定结果中存在一种以上的HLA等位基因组合方式，可以加做GSSP对模棱两可的结果进行区分。此外，由于DRB1等位基因上的DRB1*12：01/10与DRB1*14：01/54没有GSSP引物，我们则根据G组编码进行报告书写。

G组编码（G code）

G组是由WHO HLA命名委员会确定和命名。G表示具有相同的第2、3外显子序列的一组HLA-Ⅰ类等位基因或具有相同第2外显子序列的一组Ⅱ类等位基因：如DRB1*12:01:01G包括了DRB1*12:01、DRB1*12:10。

送检注意事项

• 患者输血需间隔一周后再送检配型，并且标注输血日期。

• 原始细胞太高（>80%），可能导致结果不准确。

• 患者/供者血象正常时抽5 ml血。

• 紫帽（ EDTA抗凝剂）或蓝帽（枸橼酸钠）抗凝管保存。

• 申请单上注明供、患关系，尤其是供者/患者分别写在两张申请单上需要注明，如张三患者；张四，患者张三的妹妹。

报告模板