实验16 叶绿体色素的提取分离和理化性质

一、叶绿体色素的提取与分离

【原理】 

叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。它们与类囊体膜上的蛋白质相结合，而成为色素蛋白复合体，这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。提取液可用色层分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相（流动相和固定相）间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。

【仪器与用具】

研钵2套；漏斗；100ml三角瓶；玻璃棒；剪刀；滴管；培养皿（直径11cm）；康维皿或平底短玻管（也可用塑料药瓶盖代替）；药勺；圆形滤纸（直径11cm）；滤纸条（5cm×1.5cm）。

【试剂】

95%乙醇；石英砂；碳酸钙粉；

推动剂：按石油醚︰丙酮︰苯（10︰2︰1）比例配制（体积比）。

【方法】

1．叶绿体色素的提取

    （1）取菠菜或其他植物新鲜叶片4～5片（2g左右），洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放入研钵中。

（2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加2～3ml 95%乙醇，研磨至糊状，再加10～15ml 95%乙醇，提取3～5min，上清液过滤于三角瓶中，残渣用10ml 95%乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。

如无新鲜叶片，也可用事先制好的叶干粉提取。取新鲜叶片（以菠菜叶最好），先用105℃杀青，再在80℃下烘干，研成粉末，密闭贮存。用时称叶粉1g放入小烧杯中，加95%乙醇20～30ml浸提，并随时搅动。待乙醇呈深绿色时，滤出浸提液备用。

（3）另取一研钵，放入剪碎的新鲜叶片，放入少量石英砂（不加碳酸钙粉），用水研磨。先加2ml蒸馏水，研至糊状，再加蒸馏水30ml，搅均，不过滤。

2．叶绿体色素的分离

（1）取圆形定性滤纸一张（直径11cm），在其中心戳一圆形小孔（直径约3mm）。另取一张滤纸条（5cm×1.5cm），用滴管吸取乙醇叶绿体色素提取液沿纸条的长度方向涂在纸条的一边，使色素扩散的宽度限制在0.5cm以内，风干后，再重复操作数次，然后沿长度方向卷成纸捻，使浸过叶绿体色素溶液的一侧恰在纸捻的一端。

（2）将纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中，使与滤纸刚刚平齐（勿凸出）。

 

 

 

 

 

 

 

图16-1  分离叶绿体色素的圆形纸层析装置

（纵断面）

1. 培养皿  2. 圆形层析滤纸  3. 康维皿

4. 纸捻（上部有色素样品）  5. 推动剂

（3）在培养皿内放一康维皿，在康维皿中央小室中加入适量的推动剂，把带有纸捻的圆形滤纸平放在康维皿上，使纸捻下端浸入推动剂中。迅速盖好培养皿（图16-1）。此时，推动剂借毛细管引力顺纸捻扩散至圆形滤纸上，并把叶绿体色素向四周推动，不久即可看到各种色素的同心圆环。

如无康维皿，也可在培养皿中放入一平底短玻管或塑料药瓶盖，以盛装推动剂。但所用培养皿底、盖直径应相同，且略小于滤纸直径，以便将滤纸架在培养皿边缘上。

（4）当推动剂前沿接近滤纸边缘时，取出滤纸，风干，即可看到分离的各种色素：叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色。用铅笔标出各种色素的位置和名称。

 

二、叶绿体色素的理化性质

【原理】

叶绿素是一种二羧酸—叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开；叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定；叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被H⁺所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。

皂化反应式如下：

                 COOCH₃                               COOK

C₃₂H₃₀ONMg             + 2KOH       C₃₂H₃₀ON₄Mg

皂化叶绿素

                       COOC₂₀H₃₉                             COOK

 

                                                + CH₃OH + C₂₀H₃₉OH

                                                  甲醇     叶绿醇

【仪器与用具】 

20ml刻度试管；10ml小试管；试管架；分光镜；石棉网；药匙；烧杯（100ml）；酒精灯；玻棒；铁三角架；刻度吸量管2ml、5ml各1支；火柴。

【试剂】 

95%乙醇；苯；醋酸铜粉末；5%的稀盐酸；

醋酸-醋酸铜溶液：6g醋酸酮溶于100ml 50%的醋酸中，再加蒸馏水4倍稀释而成；

KOH-甲醇溶液：20g KOH溶于100ml甲醇中，过滤后盛于塞有橡皮塞的试剂瓶中。

【方法】

用本实验第一项中提取的叶绿体色素乙醇溶液和水研磨匀浆，进行以下实验。

    1．光对叶绿素的破坏作用

    （1）取4支小试管，其中两支各加入5ml用水研磨的叶片匀浆，另外两支各加入2.5ml叶绿体色素乙醇提取液，并用95%乙醇稀释1倍。

（2）取1支装有叶绿素乙醇提取液的试管和1支装有水研磨叶片均浆的试管，放在直射光下，另外两支放到暗处，40min后对比观察颜色有何变化，解释其原因。

2．荧光现象的观察  取1支20ml刻度试管加入5ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不同？解释原因。

3．皂化作用（绿色素与黄色素的分离）

（1）在做过荧光现象观察的叶绿体色素乙醇提取液试管中加入1.5ml 20%KOH-甲醇溶液，充分摇匀。

（2）片刻后，加入5ml苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1～1.5ml蒸馏水，轻轻混匀（勿激烈摇荡），于试管架上静置分层。若溶液不分层，则用滴管吸取蒸馏水，沿管壁滴加，边滴加边摇动，直到溶液开始分层时，静置。可以看到溶液逐渐分为两层，下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素a和b（以及少量的叶黄素）；上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。

4．吸收光谱的观察  将上述已分层的试管溶液，用分光镜观察两类色素的吸收光谱，首先让下层绿色素部分对准进光孔，看光谱有何变化；然后再将上层黄色素溶液对准进光孔，看光谱又有何变化。把观察的结果用简单的图表示出来。

5．H⁺和Cu⁺⁺对叶绿素分子中Mg⁺⁺的取代作用

方法一：

（1）取两支试管，第一支试管加叶绿体色素提取液2ml，作为对照。第二支试管中加叶绿体色素提取液5ml，再加入5%HCl数滴，摇匀，观察溶液颜色变化。

（2）当溶液变褐后，再加入少量醋酸铜粉末，微微加热，观察记载溶液颜色变化情况，并与对照试管相比较。解释其颜色变化原因。

方法二：

另取醋酸－醋酸铜溶液20ml，以烧杯盛之。取新鲜植物叶片两片，放入烧杯中，用酒精灯慢慢加热，随时观察并记录叶片颜色的变化，直至颜色不再变化为止。解释原因。

【注意事项】

    1．在低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白絮状物，溶液浑浊，且不分层。可激烈摇匀，放在30～40℃的水浴中加热，溶液很快分层，絮状物消失，溶液变得清澈透明。

2．分离色素用的圆形滤纸，在中心打的小圆孔，周围必须整齐，否则分离的色素不是一个同心圆。

 

    【思考题】

    1．用不含水的有机溶剂如无水乙醇、无水丙酮等提取植物材料特别是干材料的叶绿体色素往往效果不佳，原因何在？

    2．研磨提取叶绿素时加入CaCO₃有什么作用？

    3．从叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素的吸收光谱讨论其生理意义。