木瓜蛋白酶(Papain),又称木瓜酶,是一种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜(Carieapapaya)中含有的一种低特异性蛋白水解酶,广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内,其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸,属于巯基蛋白酶,它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点,因此在食品、医药、饲料、日化、皮革及纺织等行业得到广泛应用。
组成结构
番木瓜未成熟果实中含有木瓜蛋白酶(Papain)、木瓜凝乳蛋白酶A(Chymopapain A )、木瓜凝乳蛋白酶B(Chym opapain B )、木瓜肽酶B (PapayaPeptidase B )
等多种蛋白水解酶。且已知四种半胱氨酸蛋白酶的一级结构具有高度的同源性。其中,木瓜蛋白酶属巯基蛋白酶,可水解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基端,并能优先水解那些在肽键的N-端具有二个羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽键。
木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶,分子量为23406,由一种单肽链组成,含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位,他们分别是Cys25、His159和Asp158,另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可含有:(1)木瓜蛋白酶,分子量21000,约占可溶性蛋白质的10%;(2)木瓜凝乳蛋白酶,分子量26000,约占可溶性蛋白质的45%;(3)溶菌酶,分子量25000,约占可溶性蛋白质的20%;及纤维素酶等不同的酶。
化学性质
木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末,微有吸湿性;木瓜蛋白酶溶于水和甘油,水溶液为无色或淡黄色,有时呈乳白色;几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶,具有蛋白酶和酯酶的活性,有较广泛的特异性,对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力,但几乎不能分解蛋白胨。
木瓜蛋白酶的最适合PH值6~7(一般3~9.5皆可),在中性或偏酸性时亦有作用,等电点(pI)为8.75;木瓜蛋白酶的最适合温度55~65℃(一般10~85℃皆可),耐热性强,在90℃时也不会完全失活;受氧化剂抑制,还原性物质激活。
催化机制
木瓜蛋白酶的剪切肽键的机制包括:在His-159作用下Cys-25去质子化,而Asn-158能够帮助His-159的咪唑环的摆放,使得去质子化可以发生;然后Cys-25亲核攻击肽主链上的羰基碳,并与之共价连接形成酰基-酶中间体;接着酶与一个水分子作用,发生去酰基化,并释放肽链的羰基末端。
生产方法
由木瓜的未成熟果实,经提取乳液、凝固、沉降、干燥而成粗制品。一般工业上以粗制品的应用为主。木瓜蛋白酶韵生产方法有三种,分别是直接热风烘干法、喷雾干燥法及膜分离冻干法。
直接烘干
生产方法较简单、快速,但生产出来的成品只是粗酶,杂质多、色泽差且微生物超标,酶活力也较低,只有60万~80万单位/g。多为个体工厂采用,已不能满足国内食品质量卫生安全等。
喷雾干燥
此法是先通过离心去除部分杂质后再进行喷雾干燥,所生产出的成品酶活力相对高,达到100万单位/g左右,杂质相对也较少,色泽相对也较白。但产品喷雾时容易粘壁,酶活损失较大,水溶性相对也较差,而且酶活稳定性也较差。
膜分离法
该生产方法不但避免了以上两种方法的缺点,且生产过程卫生安全,收率也高,所生产的成品酶活损失小,酶活力一般可达到280万~350万单位/g,最高可达400万单位/g,且酶活稳定性好,纯度高,色泽洁白,细菌数低,严格操作可达到医药级别。
其提取工艺条件为超声波功率300W,超声处理时间200s,果浆质量分数30%;经超声波强化提取,酶活力提高到原先的1.71倍;该酶在40℃以下,pH为5.4~6.0时酶活力相对稳定;EDTA、Cys和维生素C对酶活力具有激活作用,CuS04和ZnCl2具有抑制作用,而KCl、NaCI、CaCl2、MgS04对酶活力的影响不大。
木瓜蛋白酶的分离纯化工艺:采用初步采集处理,20%、40%硫酸铵分级沉淀、SP-sephadexC50柱色谱、羟基磷灰石柱色谱,从番木瓜乳汁中分离纯化木瓜蛋白酶。可获得比活为1184U/mg的纯酶,活力回收率为55.79%,纯度达到99.31%,为高纯度的木瓜蛋白酶。
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