2021年3月31日 星期三
作者：冯家欣 周子青 李时悦
单位：广州医科大学附属第一医院国家呼吸疾病临床医学研究中心 广州呼吸健康研究院呼吸疾病国家重点实验室
引用本文: 冯家欣, 周子青, 李时悦. 共聚焦激光显微内镜在呼吸系统疾病中的应用研究进展 [J] . 中华结核和呼吸杂志, 2021, 44(3): 260-266. DOI: 10.3760/cma.j.cn112147-20200522-00622.
摘要
共聚焦激光显微内镜（CLE）是一种新的成像技术，基于激光扫描共聚焦显微镜成像原理， 在活体内实现了细胞级别的高分辨率成像效果，使其成为了真正的“光学活检”技术。CLE同时具备高分辨率、实时成像、相对无创的特点，使其在慢性气道疾病的研究、肺部肿瘤的实时诊断、引导活检、肺部疾病动态评估和随访等方面具有重要的应用价值。本文结合国内外研究报道，综述了CLE在呼吸系统疾病中的临床应用及研究进展。
一、共聚焦激光显微内镜的基本原理及分类
1. 共聚焦激光显微内镜成像原理及分类：基于激光扫描共聚焦显微镜成像原理，工作时由激光源发射出波长为488 nm的激光束，组织中的荧光素在激光的激发下发射荧光，经探头接收后送回主机，转化为数字信号传输至计算机，最终聚合成清晰的三维动态视频图像。CLE系统主要分两种类型，一种是Pentax显微内镜系统的整合式共聚焦激光显微内镜（endoscope-integrated confocal laser endomicroscopy，eCLE），把激光发射部及图像接收部整合于可弯曲内镜前端；另一种是Cellvizio显微内镜系统的探头式共聚焦激光显微内镜（probe-based confocal laser endomicroscopy，pCLE），将激光传导和光信号接收整合到一根细长探头，可经内镜工作通道到达感兴趣部位进行探查，拓宽了探查范围。eCLE在可视范围、扫描深度均优于pCLE，过去主要用于消化道疾病，但pCLE扫描速度快，具有更强的内镜兼容性，操作方便，应用范围更广。目前在呼吸系统应用主要是法国Mauna Kea Technologies公司生产的探头式共聚焦激光显微内镜，包括探头型共聚焦激光显微内镜（probe-based confocal laser endomicroscopy，pCLE）及针型共聚焦激光显微内镜（needle confocal laser endomicroscopy，nCLE）两种类型。pCLE是一根直径为1.4 mm的半柔性探头，该探头由3 000根小光纤组成，横向分辨率为0.91 μm，观察深度为50 μm，视野范围为600 μm×600 μm，扫描速度高达12帧/s。nCLE是一根直径为0.9 mm的柔性针型导管，横向分辨率为3.5 μm，观察深度为40~70 μm，视野范围为325 μm×325 μm。pCLE成像范围更广，图像辨别度更高，nCLE可弯曲角度更大，可经穿刺针到达纵隔淋巴结进行探查。 2. 荧光造影剂的应用：外源性荧光造影剂可以增加共聚焦图像的对比度，目前用于呼吸系统的荧光造影剂主要包括10%荧光素钠以及0.05%盐酸吖啶黄。荧光素钠通过静脉注射，20 s后可显像，持续30 min，血运丰富的组织分布浓度更高，激光激发下反射亮度更强的荧光，使组织结构对比更鲜明。24 h内可代谢并完全从肾脏排泄。因荧光素钠体内注射有发生Ⅰ型超敏反应的风险，故注射前需进行药敏试验。静脉注射荧光素钠后，肺组织血运丰富区域将填充更多荧光素钠，亮度更大，可以帮助区分组织和细胞结构，辅助CLE对肺部良恶性病变进行诊断［1］。吖啶黄局部应用可清晰显示细胞核，对恶性病变的鉴别意义较大，但由于其具有潜在致DNA突变的可能性，故临床应用需要谨慎，目前较少用于体内染色。
二、pCLE在呼吸系统中的应用
1. 呼吸系统正常结构的CLE成像探索：在2007年，Thiberville等［2］首次使用pCLE在探查人体气道壁，通过体内外pCLE成像、组织病理学及自体荧光光谱对比研究证实，支气管上皮下层基底膜带的弹性蛋白受激发后可自发荧光，显示出由致密层和网状层垂直重叠成网状结构，描述了近端气道至远端呼吸性细支气管的气道上皮下层弹性纤维的排列模式（图1, 2,, 3, 4）；使用盐酸吖啶黄造影后，气道上皮层细胞核大小和排列情况清晰显现。其团队［3］进一步使用CLE探查健康受试者肺泡结构，在488 nm激光激发下图像表现为紧密排列的囊状结构和条带样结构，结合病理HE染色和荧光光谱仪证实自荧光团来源于肺泡隔的弹性蛋白，弹性蛋白主要存在于肺泡隔的弹性纤维和微血管鞘，以此发现CLE可对肺泡结构、微血管间接显像（图5，6）。在吸烟者肺泡内还发现大量高荧光巨噬细胞（图7），自荧光巨噬细胞数量及荧光密度与每天吸烟量呈正相关。光谱分析证实吸烟者肺泡内高亮度细胞为吞噬烟草焦油的巨噬细胞［4］。Thiberville团队的研究发现了肺内存在大量自荧光结构及物质，提示在CLE在呼吸系统应用有天然优势，为CLE在呼吸系统的进一步研究和应用奠定了基础。 图1~6 呼吸系统正常结构的CLE成像。图1为气管，弹性纤维紧密、规则排列；图2为右主支气管，气道上皮层基底膜区致密层和网状层相互重叠；图3右下叶前段支气管，基底膜区弹性纤维呈网状分布，*是支气管腺体开口；图4为呼吸性细支气管，基底膜区弹性纤维呈环状、螺旋状分布；图5为肺泡，肺泡呈“梯形缝合式”相互交联，蓝色箭头指示部位为肺泡口；图6蓝色箭头指示部位为小叶微血管
图7 吸烟患者肺泡的CLE图像。蓝色箭头指示部位为肺泡弹性纤维，绿色箭头指示部位为高荧光的巨噬细胞，可观察到肺泡内充满高荧光的巨噬细胞
2. CLE在肺癌中的应用：肺癌是全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤，早期诊断是降低肺癌病死率的关键［5, 6］。CLE在呼吸道恶性肿瘤的早期诊断也可发挥一定作用。Thiberville等［2］首次应用pCLE对气道癌前病变探查，表现为气道基底膜弹性纤维排列杂乱无章、其荧光强度显著降低。Fuchs等［7］对气道进行盐酸吖啶黄染色，并使用pCLE探查气道病变部位，通过细胞核染色情况、细胞核和细胞质形态特征及排列模式可区分正常上皮组织、炎症或再生上皮组织和肿瘤组织。Takemura等［8］在体外对经支气管镜肺活检样本进行吖啶黄染色后快速通过pCLE评估良、恶性，结果显示恶性肿瘤检出的敏感度为91.3%、特异度为76.9%。此外，Zirlik等［9］通过pCLE快速评估经盐酸吖啶黄或甲酚紫染色后的离体胸腔液体，可发现恶性肿瘤细胞，在吖啶黄组中恶性肿瘤检出的敏感度及特异度分别为87%、99%，而在甲酚紫组中检出恶性结果的敏感度及特异度分别为81%、92%。为了更清晰地解释CLE图像与传统组织学的相关性，Sorokina等［10］在离体实验阐明了肺癌组织在CLE的图像特征，包括肺泡壁增厚致肺泡扩张不良、肺泡水肿和存在大量巨噬细胞，肺腺癌可表现为细胞外基质高荧光渗透、黑洞形成；肺鳞癌表现为细胞基质呈高亮条索样分布，包绕低荧光的鳞癌细胞；而小细胞肺癌表现为图像荧光分散。罗为展等［11］应用pCLE对不同部位的肺癌成像特征进行了描述，肺外周病灶表现为“圆圈形”结构破坏、肺泡相互挤压、纤维成簇特点；而气管黏膜肿瘤可表现为纤维排列不规则、纤维结构成簇、缠绕。有病例报道［12］使用超声小探头或电磁导航支气管镜技术联合pCLE引导下对肺外周孤立性结节活检，结果显示在超声小探头或导航引导定位后，使用pCLE可观察病灶部位造影后显示为低荧光区域，并可以此辅助活检定位。为了解决pCLE对肺上叶或远端肺孤立性结节探查的局限性，Hassan等［13］对48例确诊为恶性孤立性结节的患者进行CLE联合超声小探头探查，包括29例应用AlveoFlex1探头（1.4 mm）和19例用于胆道探查的CholangioFlex1（0.6 mm）微型探头进行探查，结果显示CLE联合超声小探头对肺癌的诊断准确性为79.2%，其中在30例患者中可发现特异度结节影，而两种不同型号的微型探头成像特点无明显差异，因此对于距离较远、角度较大的肺外周结节，可以使用超细CLE探头引导活检。Guisier等［14］对EGFR抑制剂敏感程度不同的肿瘤细胞使用荧光探针标记后建立小鼠肺肿瘤模型，发现pCLE具有对治疗后的细胞凋亡程度进行体内、体外评估的能力。综上，CLE对于肺或气道恶性病变的实时诊断、病变范围和深度的即时判断有其独特优势。 3. 间质性肺疾病（interstitial lung diseases，ILD）：ILD是一组由不同病因导致病变累及肺泡壁的疾病统称，病因复杂，治疗困难。明确诊断对制定治疗方案至关重要。获得足量的肺组织标本是明确病因诊断的关键。相比于外科肺活检，经支气管冷冻活检术（transbronchial cryobiopsy，TBCB）可获得足量肺组织，具有更少的创伤，患者恢复更快，但气胸及出血并发症仍有较大机率发生。Wijmans等［15］通过对间质性肺疾病患者进行透视下引导pCLE及组织学的对比研究观察肺组织及胸膜结构，获得肺血管、胸膜和不同严重程度肺纤维化在pCLE中成像特征，提示pCLE 可作为指导TBCB的工具以提高病理诊断阳性率和减少并发症的发生率。Meng等［16］通过pCLE和胸部CT对比观察慢性纤维化间质性肺炎和其他类型间质性肺疾病患者，发现细胞数目增多的pCLE图像与CT炎症模式具有良好相关性，并在慢性纤维化间质性肺炎组可观察到纤维密集分布且无肺泡结构图像，提示通过pCLE可实时观察到慢性纤维化间质性肺炎晚期瘢痕形成和肺泡结构破坏的特征。Salaün等［17］描述了不同病因所致的慢性间质性肺疾病CLE图像，且发现在胸部CT中表现正常的肺组织区域中出现细支气管和肺泡壁荧光细胞浸润，这可能是病变范围逐渐扩散的缘故，提示pCLE可早于CT发现肺组织的异常表现。Bondesson等［18］通过全自动算法对肺泡弹性蛋白的结构特性进行量化，发现弹性纤维的厚度以及连通性可以区分弥漫性实质性肺疾病和正常肺组织。由于ILD的病灶分布异质性，常规肺活检取材量少，难以全面反映组织病变。CLE相对无创，通过多点探查，一定程度上可提供更全面的信息。对胸膜、肺血管结构的辨识也可用于引导冷冻肺活检，提高安全性以及减少并发症的出现。 4. 肺移植术后病情评估：在常见实体器官移植术中，肺移植术后出现排斥反应的发生率最多，根据国际心肺移植协会不同年份报告，术后1年内出现急性排斥反应29%~55%［19, 20］。肺移植术后30 d内、1年内因急性排斥反应死亡为3.6%、1.8%，闭塞性细支气管炎综合征是急性排斥反应带来的移植术后严重并发症，患者术后出现BOS的5年生存率不足50%是远期死亡的首要原因［21, 22］。病理诊断是急性排斥反应诊断的金标准，但肺移植患者基础状态较差，不适宜多点大量肺组织病理取材，使得急性排斥反应难以通过常规支气管镜活检确诊。急性细胞性排斥反应（acute cellular rejection，ACR）的病理诊断及分级［23］主要依据是肺实质血管周围淋巴细胞的浸润以及浸润程度。2012年，Yserbyt等［24］首次对肺移植术后临床状况稳定的患者前后进行pCLE探查，通过一致性检验证实了肺泡荧光细胞计数的可重复性较好，但肺泡结构测量可重复性差。因此肺泡中荧光细胞中位数计量和荧光密度可作为监测肺移植术后监测ACR的敏感指标。该研究团队［25］通过pCLE分别观察肺移植术后急性细胞性排斥反应组和肺移植术后正常组，结果显示ACR组中肺泡荧光细胞中位数计量、荧光细胞密度、录像出现荧光细胞帧数的比例以及血管指数（血管平均荧光厚度/血管平均直径）均高于正常组，分别于3、6个月后再次通过pCLE观察ACR组患者，发现肺泡中荧光细胞数目及荧光细胞密度逐渐减少，联合肺泡中荧光细胞数量、荧光细胞密度以及血管指数三个指标诊断ACR的敏感度及特异度分别是0.93、0.83。一项通过pCLE观察肺移植术后急性细胞性排斥反应的前瞻性、多中心研究［26］进一步明确了pCLE在肺移植急性排斥反应检测中的作用，研究纳入了24例患者进行30次pCLE检查，研究发现，血管周围出现荧光细胞（positive perivascular cellularity，PVC）作为评估ACR的观察指标具有良好的敏感度，其中PVC出现数目与ACR的病理分级显著相关，使用PVC这一观察指标指导肺活检术可进一步增加诊断阳性率。但研究同时发现肺泡中出现大量荧光细胞（abundant alveolar cellularity，AAC）与ACR并无明显相关性，提示AAC在判断ACR的作用仍有待验证。以上研究分别通过不同的pCLE观察指标评估ACR，由于pCLE的无创性，可多部位探查，对于无法多次、多点肺活检的肺移植患者ACR判断和指导肺活检的部位有一定价值。但目前尚缺乏CLE图像与ACR病理对应关系的研究。进一步研究CLE探测到异常改变和病理改变的对应关系，可帮助增加pCLE在ACR的诊断意义。 5. 慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）：慢阻肺的病理生理基础是由肺实质组织破坏（肺气肿）致肺弹性回缩力下降或丧失和小气道纤维化致进行性气流受限导致的肺功能持续受损。了解体内肺血管和肺泡结构病变有助于进一步阐明COPD病理生理特点和发病机制。Black等［27］通过pCLE及组织学测量弹性纤维体积占比发现肺气肿患者肺泡弹性纤维含量较正常人明显下降。Newton等［28］使用pCLE观察肺气肿患者的肺泡结构，发现肺气肿患者的肺泡入口直径增大、弹性纤维结构破坏。随后，Salaün等［29］应用pCLE观察肺血管的形态和功能，对比观察静脉注射荧光素钠后肺气肿小鼠和正常小鼠，发现肺气肿小鼠的肺泡最大直径及毛细血管间距均比对照组大，初步提出pCLE可应用于探索肺气肿的发病机制。Cosío 等［30］通过肺功能、胸部CT和pCLE对比观察非吸烟者、肺功能正常的重度吸烟者和慢阻肺患者的肺泡结构和气道结构，描述了慢阻肺患者气道弹性纤维分布的形态模式，分析肺泡形态学与肺功能指标的相关性，发现慢阻肺患者气道弹性纤维分布较正常人更松散，肺泡直径与肺功能指标如FEV1（forced expiratory volume in 1 second）、FEV1/FVC（forced expiratory volume in 1 s/forced vital capacity）、MEF（maximum expiratory flow）、TLCO（carbon monoxide lung transfer factor）呈负相关，肺泡外血管直径与Kco（carbon monoxide transfer coefficient）呈正相关。Yserbyt等［31］通过肺功能、胸部CT和pCLE对比观察健康者、肺气肿患者，pCLE可对肺泡进行形态学测量分析，结果显示肺气肿患者肺泡口最大直径、面积以及弹性纤维荧光密度明显大于健康受试者。pCLE在肺气肿患者中观察到肺泡自荧光密度与CT对肺气肿患者的定量测量值及肺功能指标具有良好相关性。以上研究结果表明，pCLE可以实时观察肺气肿患者肺泡特征性显微结构，并发现肺泡形态学测量数据及自发荧光密度与胸部CT及肺功能指标均有良好相关性，提供了现有对肺气肿或慢阻肺患者严重程度评价方法的补充信息，未来可成为对评估慢阻肺治疗干预的体内效应的观察工具。 6. 肺炎：（1）药物相关性肺炎：Salaün等［32］在胺碘酮相关性肺炎（amiodarone-related pneumonia， AMR-IP）的非吸烟患者肺泡中发现主要的CLE特征是存在一种高荧光的大细胞（>20 μm），以此为标准诊断AMR-IP的敏感度、特异度、阴性预测值和阳性预测值分别为100%、88%、100%和90%，提示pCLE药物毒性相关肺损伤的诊断有一定价值。（2）真菌感染：Morisse等［33］利用荧光标记烟曲霉菌、野生烟曲霉菌诱导的侵袭性肺曲霉病（invasive pulmonary aspergillosis，IPA）大鼠模型，在IPA大鼠肺中可观察到荧光标记的菌丝，而在局灶性炎症区域可观察到巨噬细胞的浸润，以此为标准诊断IPA的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为83%、100%、100%、94%。随后，该团队［34］探查体内曲霉菌与荧光肽示踪剂的特异结合能力，在IPA大鼠模型中静脉注射c（CGGRLGPFC）-NH2［FITC］荧光肽示踪剂，pCLE观察到肺/胸腔内壁病变区域荧光强度明显高于其他区域。另外，Vanherp等［35］证实了CLE在表达绿色荧光蛋白真菌细胞感染的小鼠模型可有效识别强荧光信号，并探索了在小动物模型中使用CLE的有效成像方法。这几项动物研究均证实联合使用靶向荧光标志物，可将pCLE的应用扩展到对体内特定分子或细胞的显像。除此之外，有病例报道［36］通过pCLE探查HRCT所显示的典型病变区域，在肺泡弹性纤维完全破坏的区域还可观察到纤丝状分支的荧光结构，可能指向曲霉菌丝。（3）细菌感染：Mills等［37］在离体试验中通过CLE成像验证细菌特异度探针识别肺内细菌的可能性。另外，也有研究者［38］通过pCLE动态观察来评估肺部感染、急性呼吸窘迫综合征的炎症、修复、纤维化的过程从而指导临床治疗。研发设计与体内大分子结合的光学荧光探针、智能探针等均有助于肺泡内细胞甚至分子水平可视化。各种注射体内的荧光探针的安全性与特异度尚需要进一步验证，需要注意的是，吸烟者的烟草焦油诱导的巨噬细胞有可能会影响成像结果。 7. 其他肺部疾病：（1）气道疾病：Yick等［39］对哮喘患者气道进行pCLE检查，发现pCLE获取气道上皮下层弹性纤维分布图像主要呈现细小纤维分布疏松、粗大纤维分布致密和混合分布三种类型，这三种CLE图像表现与组织学具有良好的一致性；使用支气管扩张剂后，粗大纤维分布致密组患者的FEV1占预计值%显著低于细小纤维分布疏松组，这可能是粗大纤维分布致密组患者的气道上皮下层弹性纤维增厚使气道管腔变窄从而改变FEV1。Newton等［40］使用pCLE观察气管支气管淀粉样变患者气道，发现病变部位的正常弹性纤维网状结构被破坏，取而代之的是斑驳棉絮状成像，这是由于淀粉样蛋白物质在黏膜和黏膜下层的沉积。Newton等［41］使用pCLE观察骨化性气管支气管病的气道，发现病变部位呈现斑驳样高亮荧光改变且丧失正常弹性纤维的网状结构；在支气管内错构瘤［42］病例中发现病变部位丧失了正常弹性纤维网状结构而存在圆形混杂改变，其成分可能是其他间充质来源的软骨小叶；在结节病［2］的气道黏膜凸起部位使用CLE观察，可见“肉芽肿样”CLE图像。（2）肺实质病变：在肺泡蛋白沉着症患者［43, 44］的肺泡中发现漂浮着形状不规则的高荧光复合物，其成分被证实为脂蛋白物质。在肺泡微结石症患者［45］的肺泡中观察到荧光亮度不均匀、类圆形的物质，此为磷酸钙微石。在转移性肺钙化患者［46］的肺泡中可见大小不一、圆形的高荧光物质。在杰氏肺囊虫肺炎患者［47］的肺泡中观察到与组织学类似的特征性渗出液，此成分由蛋白质、坏死细胞以及杰氏疟原虫组成，以此特征为诊断标准的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值可高达92%、88%、85%、94%。以上研究表明，对于某些罕见病或肺部特殊疾病，CLE可辨识其特征性改变，提示对于特殊疾病或罕见病，CLE有一定的辅助诊断和临床研究价值。
三、nCLE在呼吸系统中的应用
与pCLE相比，nCLE具有直径小、柔软的特点，过去nCLE主要用于对胰腺的探查。2016年，Benias等［48］将nCLE联合荧光素钠首次应用于疑似恶性淋巴结的探查及诊断，通过CLE图像与组织学对比，可初步识别淋巴结各层结构并描述了良性、恶性和炎症反应的淋巴结的成像特征，提示nCLE对良、恶性淋巴结的评估具有一定的潜力。Wijmans等［49］使用nCLE分别探查肺部恶性肿瘤和纵隔淋巴结，并与组织病理图像对比分析，总结了恶性肿瘤的三大CLE特征：（1）存在增大的黑暗多边形细胞；（2）黑暗多边形细胞成簇成团重叠分布；（3）部分细胞在同一方向流动；在转移性淋巴结中观察到存在至少一种以上的恶性肿瘤特征，但还可观察到淋巴结正常结构。另外，有病例报道［50］将nCLE对肺外周结节进行探查，在腺癌病灶中CLE图像表现为高亮纤维组织伴有黑洞或斑点结构；而在结核病灶中CLE图像表现为密度均一、低荧光的纤维组织及斑点结构。由于nCLE具有直径小、柔软、分辨率不低的特点，对肺外周结节辅助定位及诊断和协助肺部肿瘤分期的应用将会是未来的研究热点。
四、局限性
CLE存在一定的局限性：（1）成像原理依赖于组织的自荧光，对组织成分观察有限，不能代替组织病理学检查；（2）图像抽象，目前在呼吸系统尚无建立图谱，对于无经验人员难以解读，导致技术难以普及；（3）在气道组织中扫描深度有限，只能对上皮层进行观察，对病变的浸润程度无法判断；（4）CLE在活体肺组织探查的部位难以实现重复性，因此难以做到CLE图像与活检标本组织学形成一对一的图谱；（5）可变的信号噪音，与组织接触的深浅影响成像质量。
五、展望
CLE在活体内实现了细胞级别的高分辨率成像效果，使其成为了真正的“光学活检”技术，将共聚焦显微镜的观察范围拓宽到活体内。CLE同时具备高分辨率、实时成像、相对无创的特点，使其在慢性气道疾病的研究、肺部肿瘤的实时诊断、引导活检、肺部疾病动态评估和随访等方面发挥重要作用。尤其对于需要多点、多次病理取材但患者无法耐受的肺部病变的诊断，CLE具备独特优势。随着肺癌精准治疗的发展，荧光造影剂、分子探针技术的研发，CLE在肺癌分型的判断和靶向治疗疗效评估方面也有一定应用前景；探头可弯曲性设计可减少观察盲点；机器激发波长的可调控性将实现对组织不同成分的成像；近红外技术可以加深探查深度。综上所述，CLE技术的实时显像功能对呼吸系统疾病的随访、病情评估和及时诊断具有重要的临床意义和更为广泛的应用前景。
参考文献（略）
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