·专家述评·
唐 红
(四川大学华西医院心内科，四川 成都 610041)
【摘要】近年来,随着超声造影剂的广泛应用，弥补了常规超声诊断的一些缺陷和不足，在一定程度上提高了超声诊断的准确性，但超声空间分辨率及敏感性仍然较低。随着超声分子探针的兴起，多功能超声造影剂已成为当前超声分子影像学研究的热点，与其他影像技术相结合，可达到“优势互补”的效果。多功能超声造影剂包括靶向超声造影剂、多模态造影剂及基于超声成像的诊疗一体化造影剂,以超声分子显像为核心，结合X-射线计算机体层扫描(CT)成像、磁共振成像(MRI)、正电子发射计算机断层扫描(PET)成像和荧光成像等其他技术优势，对活体状态下的生物过程以细胞和/或分子为成像靶点，利用图像可视化细胞功能及追踪分子过程，直观地反映体内生理和病理变化过程。多功能超声造影剂的研究有助于对疾病做出更加准确的诊断，通过携载基因或药物的方式可对疾病进行诊断后治疗，具有广阔的应用前景。
【关键词】多功能超声造影剂；现状；前景
分子影像学是一门新兴的交叉学科，不仅显著提高了疾病的早期诊治水平，更有望在细胞和分子水平揭示疾病的发病机理及关键靶点。可为生物靶向药物的筛选与评价提供一种更直接、更准确、更有效的技术手段。分子影像学涉及的主要学科领域有超声、磁共振、核医学、X线计算机体层扫描、光学、分子生物学(见图1)。常用分子成像技术主要有磁共振(MRI)、X线计算机体层扫描(CT)、单光子发射计算机断层成像(SPECT)、正电子发射计算机断层成像(PET)、超声(US)、光学成像(OI)。
图1 分子影像学涉及的主要学科领域
Figure 1 The main subjects of molecular imaging
近年来随着超声造影剂的广泛应用，弥补了常规超声诊断的一些缺陷和不足，提高了超声的敏感性，但超声空间分辨率仍较低。随着超声分子探针的兴起，多功能超声造影剂成为当前超声分子影像学研究的热点。不仅能够利用超声成像技术诊断疾病，而且可以与其他成像模式相结合，达到“优势互补”的效果，对疾病做出更加准确的诊断；携载基因或药物，可对疾病进行诊断后治疗。
多功能超声造影剂包括靶向超声造影剂、多模态造影剂以及基于超声成像的诊疗一体化造影剂。多功能超声造影剂以超声分子显像为核心，结合CT和MRI等其他成像技术优势，对活体状态下的生物过程以细胞和/或分子为成像靶点，利用图像可视化细胞功能及追踪分子过程，直观地反映体内生理和病理变化过程。
靶向超声造影剂是依据靶组织或靶器官中高表达的受体，将其对应配体与微泡相连，制备成具有靶向效果的造影剂，在体内通过受体-配体反应，使带有相应配体的造影剂特异性地聚集于靶组织或靶器官，并通过超声造影技术显示靶器官或组织分子水平的病理变化，产生特异性超声靶向分子显影(见图2)。以增强显影效果，从而减少造影剂的用量以降低对正常组织产生副作用的机会。
图2 靶向微泡的结构
Figure 2 The Structures of targeted microbubble
靶向结合的两种形式[1]：被动靶向与主动靶向。前者通过微泡泡膜生物学特性与靶细胞结合，后者系微泡通过特异性抗体或配体与靶细胞结合。如：抗ICAM-1靶向液态氟碳乳剂微球制备流程分三步，第一步：普通微球，在微球外壳膜上加入生物素标记聚乙二醇，形成生物素化液态氟碳微球；第二步：加入链霉亲和素，亲和素与生物素共价结合；第三步：通过生物素-亲和素桥接作用，在微球表面耦联抗ICAM-1单克隆抗体(见图3)。激光共聚焦显微镜下抗ICAM-1靶向液态氟碳脂质微球表面可见亮绿色环状荧光(见图4)。
图3 抗ICAM-1靶向液态氟碳乳剂微球制备流程的模式
Figure 3 The preparation of anti-ICAM-1 targeted liquid perfiuorocarbon particles
图4 激光共聚焦显微镜下抗ICAM-1靶向液态氟碳脂质微球
Figure 4 Laser scanning confocal microscope image of anti-ICAM-1 targeted liquid perfiuorocarbon particles
应用：射注ICAM-1靶向微泡联合心肌超声造影技术评估大鼠心脏移植后急性排斥反应，发生了急性排斥的大鼠注射后心肌回声明显增强，而对照组注射前、后心肌回声则无明显变化。亲白细胞性靶向微泡和抗ICAM-1抗体靶向脂质微泡，联合心肌超声造影能从细胞和分子水平阐明心脏移植后急性排斥反应的病理、代谢改变的一些影像学特征，从而为心脏移植后急性排斥反应的诊断和免疫抑制药对心脏移植受者疗效的评价提供了新方法[1]。
多模态造影剂是将超声成像与其他成像模式相互融合，联合使用以实现取长补短、优势互补，为临床诊断提供更快捷、更精确和更清晰的图像，为疾病的诊治提供更多的解剖学、分子学及功能学信息。目前研究中的有超声与MRI双模态造影剂、超声与荧光双模态造影剂、超声与PET/CT双模态造影剂以及三模态造影剂等[2-5]。
2.1 主要载体——纳米级超声微泡/微胶囊(见图5):用于构建多功能试剂的纳米材料主要有量子点、铁氧纳米微粒、金纳米棒、金纳米壳。
图5 纳米级超声微泡可透过血管内皮应用于血管外靶组织成像
Figure 5 The imaging of nanoscale ultrasound microbubbles transmission vascular endothelialcellsto extravascular tissue
2.2 MRI造影剂：MRI是对水分子中的氢质子成像，不同组织中氢质子在外加磁场的作用下弛豫时间(纵向弛豫时间T1和横向弛豫时间T2)不同，因而产生的磁共振信号不同。MRI造影剂的增强显影作用主要是通过改变质子从激发态到基态的衰减速率，即改变T1和T2来实现的，通过改变弛豫时间来增强图像对比度，从而提高诊断准确率。超顺磁性氧化铁(supermagneticironoxide，SPIO) ：为T2类造影剂，主要成分是Fe3O4晶体。顺磁性造影剂：为T1类造影剂，由金属离子(如Gd3+、Mn2+)和配体螯合组成。目前应用于临床的主要有钆喷酸葡胺(Gd-DTPA)和钆特酸葡胺(Gd-DOTA)。
2.3 US/MRI双模态造影剂——包裹超顺磁性氧化铁(SPIO)的微泡造影剂：通过化学反应将SPIO结合到微泡膜壳表面的外侧，制成涂层式微泡(coated-microbubble，coated-MB)；通过物理吸附的方法将SPIO嵌入到微泡膜壳内，成为膜壳的组成成分，制成嵌入式微泡(embedded-microbubble，embedded-MB)(图6)。可通过透射电镜观察Fe3O4纳米颗粒在微泡表面的分布情况。应用：US/MRI磁性微泡大鼠体内肿瘤成像。研究表明，在相同SPIO浓度的情况下，coated-MB超声显影要优于embedded-MB，随着微泡表面SPIO浓度的增高，超声信号越强，但当浓度超过一定范围，超声信号反而会减低。Yang F等从膜壳的黏弹特性方面展开研究，结果表明随着SPIO浓度的增加,微泡膜壳的黏弹性参数出现了先减小后增大的趋势,导致微泡散射截面产生先增大后减小的趋势，SPIO在低浓度范围内，可增加微泡的声学散射特性, 但是浓度过高, 反而使膜壳变硬, 影响微泡的非线性振动[5]。装载有SPIO的微泡经许多体内、体外实验被证明可以增强MRI T2加权成像，效果与微泡中SPIO的浓度呈正比。但对于coated-MB和embedded-MB的MRI增强效果的比较，国内外研究结果存在差异，需要进一步探索。
图6 Fe3O4纳米微粒嵌入微泡膜壳
Figuer 6 Fe3O4 nanoparticles embedded mocrobubble shell
2.4 US/MRI双模态造影剂——包裹顺磁性物质的微泡造影剂：国内有学者制备了包裹钆喷酸葡胺(Gd-DTPA)和氟碳气体，膜壳为高分子材料聚乳酸-羟基乙酸(poly laetide-co-glycolide acid, PLGA)的微泡造影剂。国外有学者制备了脂质膜壳上螯合了Gd3+的微泡造影剂[6-8]。
2.5 US/MRI双模态造影剂——液态氟碳乳剂：在一定条件促发下，液态氟碳乳剂可以发生液-气相转变，使纳米微球转变成微泡，增加其与周围组织的声阻抗，从而大大增强超声造影效果[9]。
液态氟碳乳剂是一种新型造影剂，由纳米粒径的液态氟碳微球经乳化后制成，具有高携氧能力、低表面张力、生物学惰性等特点，核心为液态氟碳，如全氟己烷(PFH)、全氟萘烷(PFD)、全氟溴辛烷(PFOB)、全氟戊烷( PFP) 等，外壳为脂质或高分子聚合物。粒径在纳米级范围，在疾病状态下，可穿过血管内皮间隙，到达病变组织，实现血管外显影。显影方式为聚集显影，即只有大量聚集于靶区时，才能产生较明显的回声反射，在增强靶区显影的同时，能保持低的背景噪声。液态氟碳乳剂不像微泡类造影剂易破裂，它稳定性更高，具有更长的半衰期。可在网状内皮系统聚集，引起肝、脾组织增强显影，微球表面可连接靶向配体或负载药物，用于靶向增强肿瘤、血栓显影及将药物释放到靶组织区，以同时达到诊断和治疗的目的。虽然液态氟碳乳剂在稳定性和粒径大小上优于微泡造影剂，但回声强度与微泡造影剂比较仍较弱，这在一定程度上禁锢了其在超声显像方面的研究进展。研究发现，在一定条件促发下，液态氟碳乳剂可以发生液-气相转变，使纳米微球转变成微泡，增加其与周围组织的声阻抗，从而大大增强超声造影效果(图7)[10]。多种因素均可促进液态氟碳微球相变，例如超声(声致相变、升温、激光、细针穿刺)等。液气相变性能较好的为PFP、PFH，这与二者沸点较低有关(PFP沸点29℃、PFH沸点56℃)。
图7 液态氟碳纳米乳剂“由小变大”液-气相转变形成微泡示意图
Figure 7 Liquid perfluorocarbon nanoemulsion “small to big”phasetransition to microbubble
2.6 超声/荧光双模态造影剂：是基于荧光成像的高灵敏度和超声成像高空间分辨率的特点而制备的一种在超声与荧光下均能显像的造影剂。目前将荧分子探针与超声造影剂进行整合的方法主要是通过静电吸附层层自组装技术，将荧光分子探针与超声造影剂进行整合，并精确控制各种组分的量，以实现多模态成像。Ke H课题组采用静电吸引层层自组装技术，将碲化镉(Cd Te)量子点组装到基于表面活性剂微泡造影剂的表面上，得到了具有荧光/超声双模式成像功能的复合诊断造影制剂[11]。另有研究发现此种造影剂在携带量子点后仍然能保持很好的超声显像效果，并且微泡在高强度超声破坏下可定点释放量子点，另外局部超声还可以增加细胞对粒子的摄入进而使量子点能靶向进入肿瘤组织进行分子荧光成像，从而弥补了单一的超声成像模式灵敏度偏低且难以进行肿瘤细胞成像的缺点。
2.7 量子点(quantum dot, Qd)：是一种能发射荧光的半导体纳米微晶体，是最常用的荧光分子探针(见图8)。
图8 基于超声/荧光双模态成像的量子点-微泡复合剂
Figure 8 Fabncation of bimodal contrast agent based on quantum-dot-modified microbubbles
2.8 超声/CT双模态微泡造影剂：液态氟碳纳米脂质微球(PFOB微球)是在液态氟碳纳米粒基础上制备的一种特殊超声造影剂，微球粒径小，具有较强的组织穿透能力，循环半衰期较长，聚集在组织细胞表面时，有较强的反射和背向散射，可增强对比信号，提高信噪比，有利于超声显像。动物实验证实，PFOB微球也能有效增强大鼠肝、脾及脉管系统的CT显像[12]。金纳米棒超声造影微泡是一种大小从几纳米到上百纳米的棒状金纳米颗粒，将金纳米棒通过静电吸引层层自组装到基于聚乳酸的超声造影微泡的表面，得到超声/CT双模态造影剂。利用CT图像的高分辨率，超声与其结合弥补了自身成像灵敏度低的缺点，极大增加了靶组织与周围组织的区分度[13]。
2.9 三模态成像造影剂：荧光/US/MRI三模态成像造影剂是以聚乳酸微泡为基础，通过水/油/水双乳法将磁性纳米粒子Fe3O4成功包埋到微泡内部，并利用层层自组装技术在微泡表面吸附上荧光性能良好的 CdTe(镉碲)量子点，制备能同时用于荧光成像、US以及MRI的光/声/磁一体化多模态造影剂。US/CT/MRI三模态成像造影剂是在液态氟碳(PFOB)乳剂中引入Fe3O4颗粒，不仅改善了PFOB乳剂的声学特性，产生更强的超声回声信号，而且还具有较好的磁敏感性与射线不透过性，可进行MRI与CT显像[14-15]。
传统方法诊断和治疗各自独立，诊断用药和治疗用药不相同。具有诊疗一体化的超声造影剂是在超声实时监控下，运用这种同时载有药物或基因的复合试剂，将疾病诊断和治疗两个过程合二为一，可缩短诊治时间和提高诊治效果。新方法超声造影剂+光热治疗金纳米壳，超声造影剂携载治疗基因/药物。通过金纳米壳包覆的微胶囊可实现诊断和治疗过程的完美结合，从而减少了中间环节、给药次数和毒副作用，提高了诊断治疗效率，降低了医疗费用，为开发先进的癌症诊断治疗技术提供了新的理念和方法。将癌症的诊断和治疗两个过程融为一体，通过超声造影成像确定肿瘤的部位与大小后，可立即用近红外激光对肿瘤进行定点加热实施清除，从而避免了对正常组织的损伤，同时提高了疾病诊治的效率，因此具有显著的优越性。
金纳米壳微胶囊[16]：一种可同时用于癌症超声成像和光热治疗的多功能造影剂。光热治疗使用光吸收剂和对于人体组织穿透力较强的红外光来使组织温度升高，选择性地杀死肿瘤细胞，而对正常细胞不造成伤害。一方面，微胶囊可增强超声成像效果，通过超声成像可确定肿瘤的大小和位置，监控治疗过程以及治疗后的恢复过程；另一方面，金纳米壳在近红外区有较强的吸收，经近红外光激发后，可将吸收的光能转化成热能，使局域范围内温度升高，有效地杀死恶性肿瘤细胞，对肿瘤进行光热治疗(图9)。
超声微泡造影剂携带药物/基因+超声靶向破坏微泡(UTMD)：携带药物或基因的微泡类超声造影剂到达特定组织时，先根据携带的配体执行诊断功能，再利用高机械指数的超声照射使微泡破裂，在特定组织从微泡内释放出药物或治疗基因，从而达到对病变部位的靶向治疗目的。在超声照射引起微泡破裂的同时，其伴随产生的冲击波可导致特定部位的毛细血管和细胞膜的通透性增加，使得药物或治疗基因更容易进入病变组织和细胞内，增强了治疗效果(图10)。
图9 右上图：注射金纳米壳微胶囊造影剂后肾脏显像，呈增强模式 右下图：注射金纳米壳微胶囊造影剂后进行激光照射，组织被热消融，无造影剂分布
Figure 9 Gold nanoshell microcapsule ultrasound contrast imaging and photothermal therapy
图10 超声微泡携载治疗基因/药物的方式
Figure 10 Ultrasound-mediated gene or drug loaded microbubbles
血栓诊疗：携带溶栓药物的亲血栓性微泡类靶向超声造影剂，在超声照射作用下使其破裂，在血栓形成部位释放出溶栓药物如尿激酶、链激酶等，可有效增加该部位的药物浓度，提高溶栓治疗的效果，同时降低了溶栓药物引起出血等并发症的风险[1]。
多功能超声造影剂改进了传统超声造影剂单一增强超声成像模式，综合了多种成像技术优势，在细胞或分子水平直观反映体内生理和病理变化过程。多功能超声造影剂的研制和开发，为疾病的靶向诊断与治疗开辟了新的思路，具有广阔应用前景。多功能造影剂在动物实验中取得了令人鼓舞的结果，但应用于临床的安全性还需进一步论证。
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The research status and application prospects of multifunctional ultrasound contrast agent
TANG Hong
(Department of Cardiology, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China)
【Abstract】Extensive application of ultrasound contrast agents have remedied the limitations of conventional ultrasound and improved the accuracy of diagnosis. However, the resolution of ultrasonic image and sensitivity remain unsatisfactory. With the development of ultrasound molecular probes, combination of multifunctional ultrasound contrast agents with different imaging modalities may further improve diagnostic and therapeutic processes by complement each other's advantages. Therefore, it has become the focus of ultrasound molecular imaging research. The multifunctional ultrasound contrast agents included targeted ultrasound contrast agent, multimodal contrast agent and theranostic agent based on ultrasound imaging. When combined with the advantages of X-ray computerized tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), positron emission tomography (PET) and fluorescence imaging, the multifunctional ultrasound contrast agents could be used for visualization of cellular function and tracking of molecular processes through targeted cells and/or molecules in vivo, which reflect intuitively the physiological and pathological changes. The multifunctional ultrasound contrast agents have broad application prospect, they may improve the accuracy of diagnosis and also play a role in therapeutic process by carrying genes or drugs.
【Key words】Multifunctional ultrasound contrast agent; Current situation; Prospect
基金项目：国家自然科学基金面上项目(30872535)；四川省科技支撑计划项目(2008SZ0198)
执行编委简介：唐红，教授，主任医师，硕士生导师，四川大学华西医院心内科副主任兼超声心动图室负责人，四川省学术和技术带头人。从事心血管超声临床、教学和科研工作33年，擅长先天性心脏病及心脏瓣膜病超声诊断。研究方向：实时三维超声心动图，开展的主动脉根部解剖的三维超声形态学研究处于国内领先水平。承担国家级和省部级科研课题10余项，其中“ICAM-1靶向氟碳乳剂对再灌注损伤心肌的超声显像和抗损伤作用”获国家自然科学基金和四川省科技厅基金资助；“实时三维超声心动图在心血管疾病疹治中的应用”获四川省科技进步奖；主编、主译学术专著5部，以第一作者和通讯作者身份发表论文100多篇。2012年被中国超声医学工程学会授予优秀超声医学专家。现任中国超声医学工程学会常务理事、超声心动图专业委员会副主任委员；中国医师协会超声医师分会委员、超声心动图专业委员会常委；中国医师协会儿科医师分会儿科影像学专业委员会常委；中国医师协会心血管内科医师分会超声心动图委员会委员；中国医学影像技术研究会超声专业委员会委员、超声心动图专业委员会常委；海峡两岸医学卫生交流协会超声医学专家委员常委；中国医疗保健国际交流促进会超声医学分会委员；四川医学会超声专业委员会主任委员；四川省医师协会超声医师分会会长；四川省超声医学工程学会副会长；四川省超声质量控制中心专家。《中国超声医学杂志》《西部医学》等多种杂志编委。E-mail: hxyyth@qq.com。
【中图分类号】R445.1
【文献标志码】A
doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2017.04.001
(收稿日期：2016-11-29;编辑：何兴华)
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