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·论著·

中国汉族人群COPD吸烟史患者HHIP基因多态性与肺癌的相关性研究*

王海涛　许靖　张舒　肖中　蔡峰　范艳红　李挺　生淑红　付佑辉　池峰　周晨

(上海中医药大学附属第七人民医院呼吸内科， 上海 200137)

【摘要】目的　探讨中国汉族人群COPD吸烟史患者HHIP基因多态性与发生肺癌风险的相关性。方法　以672例COPD患者作为研究对象，依据病情分为试验组(COPD合并肺癌患者，n=265)和观察组(单纯COPD患者，n=207)，采用连接酶检测反应法对患者HHIP基因的多态性位点rs1489758、rs1489759、rs10519717、rs13131837、rs1492820、rs7689420进行多态性分析。对连锁不平衡性分析及SNP点基因型与肺癌风险进行Logistic回归分析。结果　HHIP基因位点rs1489758、rs1489759、rs10519717、rs13131837、rs1492820、rs7689420经Hardy·Weinberg平衡检验，均符合H.W平衡定律(P>0.05)，具有群体代表性。以是否合并肺癌为因变量，各研究位点基因型多态性为自变量，行Logistic回归分析(年龄、性别、吸烟状况进行校正)，结果显示，HHIP基因位点rs1489758、rs1489759、rs10519717、rs13131837、rs1492820、rs7689420与COPD患者是否并发肺癌无统计学关系(P>0.05)。结论　本研究未发现HHIP基因的6个多态性位点与中国汉族COPD患者的肺癌发病风险有明确相关性。

【关键词】COPD；HHIP；基因多态性分析；肺癌；LDR

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)和肺癌是吸烟患者所导致的呼吸道最常见疾病，研究表明：吸烟所产生的尼古丁等有害物质及患者的基因易感性是导致这两种疾病在吸烟人群中高发的重要原因。近年来有研究表明：伴有吸烟史的COPD患者中有高比例患者会发生肺癌：有50%～90%的肺癌患者都有明确的COPD病史，有约40%～77%的COPD患者及15%～25%的肺癌患者有遗传倾向[1-2]。有学者认为：伴有吸烟史的部分COPD患者及肺癌患者可能存在共同的病理过程和易感基因。且有研究报道人认为HHIP(human hedegehoginteratting protein,HHIP)基因多态性与COPD患者发生肺癌相关[3-5]。但目前研究报道对象均为欧美人群，无亚洲人群和中国人群的研究报告，而国外所报道的研究结果是否符合亚洲及中国人群的基因特点目前仍不清楚。因此本研究以中国汉族COPD及COPD合并肺癌患者为主要研究对象，对HHIP基因的多态性位点进行检测，旨在从分子水平上探索HHIP基因多态性与汉族COPD患者发生肺癌风险之间的关系，现将结果汇报如下。

1　资料与方法

1.1　一般资料　选取2013年1 月至2015年7月期间在上海市第七人民医院呼吸内科及肿瘤科住院治疗的慢性阻塞性肺疾病患者672例作为研究资料，所有患者均有明确的吸烟史，吸烟史以包×年为单位，其中男性529例，女性143例，年龄54～70岁，均为汉族，彼此无亲缘关系，依据病情分为两组，465例COPD合并肺癌患者(试验组)和207例单侧COPD患者(观察组)，见表1。

表1　两组患者一般情况比较

Table 1　The general data

项目观察组(n=207)试验组(n=465)P男/女152/55377/880.032年龄(年)61±764±60.756烟草暴露(包/年)41±2547±200.588肺功能(FEV1%)54±451±70.601

1.2　方法

1.2.1　患者DNA的提取　所有患者均在入院即刻抽取外周血静脉5mL，采用枸橼酸管抗凝保存，选取全血基因组DNA提取试剂盒(美国Promega试剂盒)，参照试剂盒说明书，对全血基因组DNA进行提取，之后立即于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.2　引物设计　于http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-perl/gbrowse/hapmap_B36/(国际人类基因组单倍图计划)网站，参数设置：r2>0.8，MAF>0.05，目标人群为中国人群；为了反映整个基因的信息，我们选择了该基因的所有的6个标签SNPs：rs1489758、rs1489759、rs10519717、rs13131837、rs1492820、rs7689420，查阅相关文献选择设计HHIP基因引物[6-10]，并交由上海瀚宇生物工程有限公司最后合成，具体序列见表2。

1.2.3　连接酶检测反应法分析HHIP基因多态性　　其中DNA模板1 μL，10×Buffer 2 μL，MgCl0.6 μL，dNTP 2 μL，上下游引物混合2 μL，Taq酶0.2 μL，补水至20 μL。扩增条件：95 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s，35个循环；65 ℃ 3 min。连接反应：PCR产物4 μL，10×Taq DNA、Ligase Buffer 1 μL，TaqDNA Ligase(2 U/μL)0.05 μL，探针(2P)1 μL/条，补H2O至10 μL。连接条件：94 ℃ 15 s，50 ℃ 25 s，40个循环。取1 μL延伸产物，加8 μL Loading Buffer，94 ℃变性3 min，立即冰水浴，上测序仪。

表2　相关SNP位点的引物序列

Table 2　Primer sequences related to SNP loci

SNP位点引物上游5'-3'引物下游3'-5'rs1489758GCTTAACAGATTACAGGTGGTGGTAAAGAAGGCACCAACGrs1489759AACATGTCCCAAAACCACCCGAAATTGTTTTCTTTGGACrs10519717GTTTCTTGATAGATATCCTCCATGCACCACAATGTCTAACrs13131837TGGAGTAGACCATAATTTCTTTCCAAACATTTGCTATGGCTCAGArs1492820TCTGGCTGCTCACTGAATTTTCCATTGGCTCCGTTCTTCTArs7689420GCTGTGCAAACTTGCCTATCCACACTGTTCATCGCGATTC

1.3　统计学分析　采用SPSS 19.0统计学软件进行实验数据分析，正态计量数据用

±s表示，正态资料组间比较采用t检验，样本率的比较采用卡方检验；以P<>

2　结果

2.1　连锁不平衡性分析　本研究中的HHIP基因位点rs1489758、rs1489759、rs10519717、rs13131837、rs1492820、rs7689420经Hardy·Weinberg平衡检验，均符合H.W平衡定律(P>0.05)，具有群体代表性，见表3。

表3　两组患者SNP位点的连锁不平衡性分析结果

Table 3　Linkage disequilibrium analysis of SNP locus

SNP位点等位基因HWEP值最大基因频率(MAF)观察组(n=465)对照组(n=207)P值rs1489758A/C0.9210.2890.2970.327rs1489759C/T0.9940.2770.3110.389rs10519717C/T0.9250.2720.3010.299rs13131837C/T0.9780.3110.2970.301rs1492820A/G0.9170.2920.2860.329rs7689420C/T0.9520.2840.3010.317

2.2　SNP点基因型与肺癌风险Logistic回归　以是否合并肺癌为因变量，各研究位点基因型多态性为自变量，行Logistic回归分析(年龄、性别、吸烟状况进行校正)，结果显示，HHIP基因位点rs1489758、rs1489759、rs10519717、rs13131837、rs1492820、rs7689420与COPD患者是否并发肺癌无统计学关系(P>0.05)，见表4。

表4　各SNP点基因型与肺癌风险Logistic回归分析结果

Table 4　Logistic regression analysis of SNP genotype and lung cancer risk

SNP位点基因型观察组(n=465)对照组(n=207)P矫正前矫正后矫正OR值(95%CI)rs1489758AA2041010.6110.5721AC170511.162(0.87～1.352)CC90541.207(0.724～1.578)rs1489759CC1971150.5940.5531CT182551.148(0.889～1.425)TT86371.117(0.751～1.766)rs10519717CC2171210.4891CT155520.4111.368(0.953～1.507)TT93341.462(0.751～1.690)rs13131837CC1891030.1610.1561CT177601.962(0.766～1.209)TT99340.700(0.486～1.009)rs1492820AA2051070.5590.4181AG174521.159(0.925～1.453)GG86481.120(0.751～1.671)rs7689420CC1991090.5450.4651CT181611.126(0.899～1.412)TT85371.113(0.746～1.661)

3　讨论

COPD合并肺癌是近年的研究热点，通过对年轻人、健康吸烟者与COPD和肺癌高危人群的研究，或许可以进一步揭示COPD与肺癌的复杂分子生物学关系，发现早期癌变过程中新的分子生物学标志物，从分子和细胞水平筛查出有支气管癌前病变的高危人群及肺癌患者[10-11]。为肺癌的甲期诊断和治疗提供手段，甚至实现肺癌的预防，在伴有吸烟史的肺癌及COPD患者中所进行的全基因组关联研究(GWAs)结果表明：在所发现有意义的染色体位点中，15q25、4q31及6q31在这2种疾病中出现重叠[12-13]。因此对于吸烟患者，这些重叠染色体位点所编码的基因则可能成为这2种疾病的共同易感基因。4q31染色体位点编码的HHIP基因是Hedgehog(Hh)信号通路的关键调解因子. Hh信号通路最早发现于果蝇胚胎中，在多种组织中均有表达，参与组织的发生、修复和异常增生，Hh信号通路激活的同时，可通过Hh蛋白激活HHIP基因的表达，HHIP蛋白与Hh信号通路中的3个Hh蛋白(即Shh、Dhh、Ihh)相结合使其失活，从而反馈抑制Hh信号通路的活性[14-15]。

对于吸烟的COPD患者，烟草产生的尼古丁等有害物质可破坏呼吸道上皮的完整性。生理情况下，Hh信号通路的再激活可能与气道上皮对尼古丁等有害物质产生的刺激应答有关，呼吸道上皮受到损伤后，其组织内Hh信号通路被再激活，通过调控干细胞及祖细胞的增殖分化，进一步诱导再生的远端肺间质细胞分化为平滑肌细胞，从而促进组织修复[16-17]。然而，再激活的Hh信号通路需要通过HHIP基因的负反馈抑制而正常下调，其负反馈机制一旦出现异常，则会失去对上述分化过程的正确调控，导致上皮细胞生长分化缺陷。Madison等的研究发现：HHIP基因表达异常的胎儿期小鼠，其小肠上皮表现出异常的泛平滑肌化；如果类似的变化出现于小气道，就可能影响气道平滑肌层的厚度，引起肺组织结构塌陷，从而在一定程度上导致气流受限[18]。

吸烟是肺癌发生的危险因素，尼古丁等有害物质可破坏呼吸道上皮的完整性，通过再激活Hh信号通路来实现上皮细胞层修复。活化的Hh信号通路通过上调HHIP基因的表达，负反馈抑制Hh信号通路的持续活化。在病理条件下，则可出现Hh信号通路持续异常激活，导致Shh及Glil、Gli2呈现过度表达，激活下游基因的转录，细胞增生失去调控，增生紊乱甚至恶变，过度活化致恶性肿瘤的发生[19]。Watkins等在肺癌组织中检测到Shh和Glil的共表达及HHIP的表达下降，缺乏HHIP基因反馈抑制的Hh信号通路持续活化，维持恶性肿瘤细胞活性使其不断增殖、生长[20]。

4　结论

吸烟是导致肺癌的主要危险因素，但有约80%的吸烟人群不会罹患肺癌，同样对于COPD患者，也有部分病例无并发肺癌的倾向[1]。那么对于不同遗传背景的人群，研究其单核苷酸多态性(single nucleotide poly morphism，SNP)有助于解释个体的表型差异以及不同群体和个体对疾病的易感性。单核苷酸多态性是指在基因组内某一特定核苷酸位置上存在转换、颠换等变化，SNP的位点极其丰富，几乎遍及整个基因组，不同人群中，SNP的分布存在差异。本研究以汉族人群中COPD合并肺癌患者465例为研究对象，同期单纯COPD患者207例作为对照， 旨在通过对照设计研究探讨HHIP基因多态性与COPD并发肺癌风险之间的关系，分别选取6个MAF大于5%的多态性位点rs1489758、rs1489759、rs10519717、rs13131837、rs1492820、rs7689420进行分型和监测。经统计学分析,以上多态性位点在2组患者差异无统计学意义。因本研究样本量较少，具有一定的局限性，还有加大样本量后做进一步的研究。

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Association of HHIP gene polymorphism and lung cancer in Chinese Han population with COPD smoking history

WANG Haitao,XU Jing,ZHANG Shu,et al

(Department of Respiratory Medicine, The Seventh People′s Hospital of Shanghai, University of TCM, Shanghai 200137, China)

【Abstract】Objective　To investigate the association of HHIP gene (protein Hedgehog-interacting, HHIP) polymorphism with the risk of lung cancer in Chinese Han population with COPD smoking history. Methods　672 patients with COPD were used as the research object. According to the condition of the patients, the patients were divided into test group (patients with COPD and lung cancer.n=265) and observation group (patients with unilateral chronic obstructive pulmonary disease (COPD), n=207). By using the ligase detection reaction (ligase detection reaction, LDR), polymorphism of HHIP gene at rs1489758, rs1489759, rs10519717, rs13131837, rs1492820 and rs7689420 were detected. SNP genotype and lung cancer risk were analyzed. Results　 HHIP of rs1489759, rs10519717, rs13131837, rs7689420, rs1492820 and rs1489758 were accord with Hardy·Weinberg equilibrium test (P>0.05), which were representative of the population. Logistic regression analysis showed that HHIP gene polymorphism of rs1489758, rs1489759, rs10519717, rs13131837, rs1492820 and rs7689420 were not related to and COPD patients with lung cancer (P>0.05). Conclusion　There is a clear correlation between the 6 polymorphisms of HHIP gene and the risk of lung cancer in Chinese Han COPD patients.

【Key words】HHIP; COPD; Gene polymorphism analysis; Lung cancer; LDR

基金项目：上海市卫计委青年科研项目(20124y115)

通讯作者：许靖,E-mail:[e-mail]

【中图分类号】R 734.2

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.08.021

(收稿日期：2016-01-06； 编辑： 张文秀)