王 薇，茹 颖，宋红梅，连冬梅
中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院儿科，北京100730
【摘要】目的 探讨槐杞黄颗粒单独应用或与泼尼松联用对阿霉素肾病大鼠细胞免疫及体液免疫功能的影响以及对蛋白尿的作用。方法 雄性SD大鼠50只，随机平均分为5组 (n=10)。4组经尾静脉注射盐酸多柔比星 (6.5 mg/kg)制作肾病模型，另一组注射生理盐水为正常对照组。2周后造模成功，每日灌胃治疗6周。给药剂量如下:正常对照组 (A组)及肾病生理盐水组 (B组)给予生理盐水2 ml;肾病泼尼松组 (C组)给予泼尼松液2 mg/kg;肾病槐杞黄组 (D组)给予槐杞黄颗粒液2 g/kg;肾病槐杞黄泼尼松联用组 (E组)给予槐杞黄液2 g/kg及泼尼松液2 mg/kg。比较各组死亡率、体重变化趋势、24 h尿蛋白增长量，血清IgA、IgG、IgM，以及淋巴细胞亚群CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、CD45RA+B细胞、CD161a+NK细胞比率的差异。结果 所有大鼠均成功造模，24 h尿蛋白均值为(0.389±0.273)g/24 h。C、E组死亡率显著高于A、B组 (P＜0.05)，C、D、E 3组之间差异无统计学意义。正常对照组体重持续增长，其余4组给药2周前体重呈增长趋势，之后呈下降趋势，4组之间差异无统计学意义。4组肾病大鼠给药6周后24 h尿蛋白量均增长，增长量分别为 (0.313±0.266)、 (0.404±0.235)、 (0.120±0.628)、 (0.480±0.229)g/24 h，差异无统计学意义。5组之间CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、CD45RA+B细胞、CD161a+NK细胞在全血中的比率差异均无统计学意义。B组的IgA、IgG及IgM显著高于A组;C组的IgA、IgG及IgM均显著低于B组;D组IgA显著低于B组，IgG显著低于A、B组，IgM显著高于A、C组;E组IgA、IgG显著高于A、C、D组，IgM显著高于A、C组 (P均＜0.05);各指标其他两组间比较差异均无统计学意义。结论 极严重肾病大鼠体液免疫功能亢进，槐杞黄可发挥双向免疫调节作用，单用时可下调亢进的免疫功能，与泼尼松效果相近;与泼尼松联用时，可上调泼尼松对机体的免疫抑制作用，与泼尼松相拮抗。本研究未发现各种治疗对细胞免疫的影响及对尿蛋白增长量的作用。
【关键词】槐杞黄;阿霉素肾病大鼠;免疫调节;泼尼松;药物拮抗作用
Med J PUMCH，2015，6(5):343－347
肾病综合征存在体液及细胞的免疫功能失调，目前治疗主要应用肾上腺皮质激素和/或免疫抑制剂。阿霉素肾病大鼠模型被广泛应用于肾病研究，其病理学改变类似人类的微小病变肾病或局灶节段性肾小球硬化。槐杞黄颗粒是由槐耳菌质、枸杞子、黄精配制而成的中成药，有抗炎、抗过敏、改善微循环、去除陈旧组织、增强免疫力、促进组织修复的作用。本研究将探讨槐杞黄颗粒单独应用或联合泼尼松治疗对阿霉素肾病大鼠细胞免疫及体液免疫功能的影响以及对蛋白尿的治疗作用。
阿霉素肾病大鼠模型造模及分组
一月龄雄性SPF级SD大鼠50只 (统一购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，体重约140 g，随机编号分为5组，每组10只，组别:生理盐水组 (正常对照组，A组)、肾病生理盐水组 (肾病自然病程发展对照组，B组)、肾病泼尼松组 (阳性对照组，C组)、肾病槐杞黄组 (D组)、肾病槐杞黄泼尼松联用组 (E组)。适应性喂养2周，采用新型尾缘静脉注射方法造模，目前该技术方法已获专利授权 (专利号:ZL 2013 2 0402449.1)。生理盐水组经尾静脉注射生理盐水0.5 ml;其余4组经尾静脉注射6.5 mg/kg盐酸多柔比星 (深圳万乐药业有限公司)造模。注射2周后24 h尿蛋白＞100 mg/24 h，为造模成功。
药物配制及给药方法
造模成功1周后，开始给药。所有药物均为每日新鲜配制。泼尼松液:将10 mg醋酸泼尼松片 (天津力生制药股份有限公司)研磨后溶于生理盐水，使终体积为30 ml，制成0.33 mg/ml混悬液;槐杞黄液:将10 g槐杞黄颗粒 (启东盖天力药业有限公司)溶于生理盐水制成0.33 g/ml混悬液;泼尼松+槐杞黄液:将10 mg泼尼松片研磨后及10 g槐杞黄颗粒溶于生理盐水，终体积为30 ml。各组每日灌胃给药6周:A、B组给予生理盐水2 ml;C组给予泼尼松液2 mg/kg;D组给予槐杞黄液2 g/kg;E组给予泼尼松+槐杞黄液6 ml/kg(剂量为槐杞黄2 g/kg、泼尼松2 mg/kg)。
24 h尿蛋白定量
造模前、后及给药6周后各进行一次24 h尿蛋白定量。动物禁食禁水，置于代谢笼中24 h留尿，以避免食料堵塞代谢笼或饮水稀释尿液造成的误差。24 h后量取尿量，应用美国贝克曼库尔特5800全自动生化分析仪双缩脲法检测24 h尿蛋白。
流式细胞术检测淋巴细胞亚群及ELISA法检测血清IgA、IgG、IgM
给药6周后，用5 ml/kg水合氯醛腹腔注射麻醉动物，开腹取腹主动脉抗凝血2 ml，促凝血4 ml。新鲜抗凝血用于流式淋巴细胞检测，所用流式检测抗体为BD公司 RAT CD3-APC(货号 557030)、RAT CD4-PE (554838)、RAT CD8A-FITC(554856)、RAT CD45RAFITC(554883)及CD161A NKR-P1A PE(555009);相对应同型对照也均为BD公司生产，货号分别为550883、553457、550616、551954及550617。按照说明书进行操作，每个样品有两管检测管及两管同型对照，其中CD3、CD4、CD8置于同一管中检测T细胞各亚群比例，CD3、CD45RA、CD161A置于同一管中检测T细胞、B细胞及NK细胞比例。促凝血3900×g离心分离血清后，分别应用大鼠 IgA、IgG、IgM ELISA试剂盒 (北京海诚远宏科技有限公司)检测血清中IgA、IgG及IgM，所有样品均设置复孔，取均值用于统计分析。
统计学处理
应用SPSS 19.0对数据进行统计，P＜0.05表示差异有统计学意义。应用方差分析对计量资料进行各组比较，差异有统计学意义则进行两两多重比较，如果方差齐，则选用LSD比较，方差不齐，选用Tamhane比较;对计数资料选用卡方检验。具体如下: (1)应用卡方检验对各组动物的生存率进行比较。(2)对造模前、造模成功时、给药1周、2周、3周、4周、5周、6周时各组体重进行趋势分析，并应用多重比较进行组间比较。(3)对给药6周后较造模成功时各组24 h尿蛋白的增长量进行方差分析，比较各组间是否存在差异，如果存在则应用多重比较对各组进行两两比较。(4)对各组动物的血清IgA、IgG、IgM及CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、CD45RA+B细胞、CD161a+NK细胞各项指标分别进行方差分析判断是否存在差异，如果存在则应用多重比较对各组进行两两比较。
肾病造模结果
造模的40只大鼠2周后24 h尿蛋白定量均大于100 mg/24 h，24 h尿蛋白定量为 (0.389±0.273) g/24 h、(1.254±0.764)g/(kg·24 h)。造模成功率为100%。
各组存活情况比较结果
A、B组全部存活，C组死亡3只，D组死亡2只，E组死亡4只。因50%单元格期望计数＜5，所以应用似然比卡方检验，差异具有统计学意义 (P= 0.022)。两两似然比卡方检验提示:A、B组分别与C组、E组比较差异具有统计学意义 (P＜0.05)，C、D、E 3组之间差异均无统计学意义。
体重变化趋势
经Tamhane多重比较，B、C、D、E组体重的重复分析结果示4组间两两比较差异均无统计学意义(P均＞0.05)，A组与其他4组两两比较，差异均具有统计学意义 (P均=0.000)。经趋势分析，A组体重一直呈上升趋势，其余4组在给药2周前体重呈上升趋势，之后呈下降趋势 (图1)。
24 h尿蛋白变化量比较结果
造模成功、给药6周时的24 h尿蛋白定量数据及尿蛋白的增长量见表1。除A组外，其余4组的尿蛋白均升高。对尿蛋白的增长量进行方差检验，差异有统计学意义 (P=0.000)。各组两两多重比较示:A组与B、C、E 3组差异均有统计学意义 (P＜0.05)，与D组差异无统计学意义;B、C、D、E 4组之间两两比较差异均无统计学意义。
图1 5组大鼠的体重变化趋势图
1.造模时;2.造模2周时;3.给药时 (造模成功后1周);4.给药1周时;5.给药2周时;6.给药3周时; 7.给药4周时;8.给药5周时;9.给药6周时
淋巴细胞亚群比较结果
各组T淋巴细胞亚群 (CD3/4/8)中CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+细胞比率及T/B/NK细胞亚群中CD3+(T)、CD45RA+(B)及CD161a+(NK)细胞比率见表2。经方差分析，5组大鼠淋巴细胞各亚群比率差异均无统计学意义 (P均＞0.05)。
血清IgA、IgG、IgM比较结果
方差分析比较大鼠的血清IgA、IgG及IgM，5组间差异均有统计学意义 (P均=0.000)。Tamhane多重比较结果示:B组的IgA、IgG及IgM均显著高于A组;C组的IgA、IgG及IgM均显著低于B组;D组IgA显著低于B组，IgG显著低于A、B组，IgM显著高于A、C组;E组IgA、IgG显著高于A、C、D组，IgM显著高于A、C组 (P均＜0.05);各指标其他两组间比较差异均无统计学意义 (表3)。
表1 5组大鼠24 h尿蛋白变化量 (
与A组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01
组别 造模成功时 给药6周时 增长量A组0.038±0.022 0.021±0.007 －0.170±0.021 B组 0.244±0.161 0.557±0.372 0.313±0.266*C组 0.370±0.120 0.774±0.208 0.404±0.235*D组 0.551±0.490 0.671±0.257 0.120±0.628 E组 0.361±0.130 0.841±0.185 0.480±0.229＊＊
表2 5组大鼠CD3/4/8 T细胞及T/B/NK细胞比率比较 (
组别T/B/NK CD3+ CD3+CD4+ CD3+CD8+ CD3+ CD45RA+ CD161a CD3/4/8 + A组 55.49± 8.21 42.14± 6.50 14.01±4.81 55.17± 7.88 21.14± 9.32 20.55±7.42 B组 62.40± 4.04 49.99± 6.32 12.72±3.80 60.77± 3.53 19.43± 7.18 16.57±6.66 C组 60.53± 9.05 41.70±20.27 8.41±4.82 60.26± 8.35 14.95± 5.38 19.53±9.85 D组 59.39±12.77 46.85±10.18 14.31±5.62 59.08±13.93 23.89±10.81 15.61±8.73 E组 57.77± 5.06 47.20± 4.27 11.38±3.43 54.70± 4.26 24.15± 4.20 17.43±7.07 P值0.430 0.166 0.540 0.450 0.484 0.603
表3 5组大鼠血清IgA、IgG、IgM比较 (
与A组比较，*P＜0.05;与B组比较，P＜0.05;与C组比较，*P＜0.05;与D组比较，§P＜0.05
常规的尾缘静脉注射阿霉素方法可能出现注射针未进入血管推注，多次进针推注造成漏液、剂量不准，无法判断进入血管的精确药量，药物进入皮下造成鼠尾坏死脱落甚至死亡等情况，造模成功率较低。本研究采用了新技术进行造模，目前已获专利授权。该技术可确保注射针在大鼠静脉内然后进行药物推注，对进入大鼠静脉的药物进行精确定量，严格按照预计剂量给药。经新技术6.5 mg/kg盐酸阿霉素造模的50只大鼠全部存活，且鼠尾无一脱落，造模成功率100%，24 h尿蛋白定量达到 (0.389± 0.273)g/24 h、 (1.254±0.764)mg/(kg·24 h)。虽然造模成功率高，但尿蛋白量过大，到研究后期，每日尿蛋白流失量高达动物体重的1/300，使本研究中的肾病大鼠病情过重，研究终点时死亡率较高，一定程度上影响了药物疗效的观察。
在极大量蛋白尿的严重肾病情况下A、B组均存活，C、E组死亡率显著高于A、B组，D组与其余4组均无差异。在研究过程中，给药治疗2周后，C、E组骨质疏松明显，爬行困难，活动减少，牙齿脱落无法进行正常食疗，改以软食。造模的4组大鼠活跃度逐日下降。推测在极其严重肾病情况下，药物的一些不良反应可能加速大鼠死亡。
肾病造模的4组动物在给药2周前体重呈上升趋势，之后呈下降趋势。每日尿蛋白大量流失导致动物体重下降。在极大量蛋白尿的严重肾病基础上，治疗6周后4组动物的尿蛋白均增加，B、C、D、E 4组差异无统计学意义，A组显著低于B、C、E组，但与D组差异无统计学意义。说明在这种严重肾病情况下，槐杞黄可能会减少尿蛋白的增长量，但由于存活例数较少，与未治疗的B组相比差异不明显。Zhu等［1］的研究中，2 mg/kg槐杞黄治疗2周可以降低阿霉素肾病大鼠的蛋白尿水平，并且使体重增长。该研究应用5 mg/kg阿霉素造模，在给予阿霉素注射第2天即给予槐杞黄治疗，其模型对照组造模15 d的尿蛋白水平为 (56.90±17.30)mg/24 h，未达到100 mg/24 h的肾病水平。该研究动物用药早，病情轻。其研究结果说明槐杞黄对阿霉素造成的损伤有保护作用，但因模型未达到肾病水平，所以不能提示槐杞黄对肾病的治疗效果。本研究的局限性在于模型尿蛋白过高，动物病情过重，经治疗后尿蛋白均未下降，但肾病槐杞黄组的尿蛋白增长量与正常组相近，且有一只大鼠从造模成功时的1.82 g/24 h降到了0.36 g/24 h。进一步研究应降低阿霉素注射剂量使尿蛋白水平维持在略高于100 mg/24 h水平，并增加样本量对尿蛋白变化进行观察。
未治疗的肾病大鼠的IgA、IgG及IgM均显著高于正常对照，说明阿霉素肾病模型的体液免疫功能亢进，免疫应答加强。泼尼松治疗可以将升高的IgA、IgG及IgM下调至正常水平;槐杞黄可以下调IgA及IgG，治疗效果与泼尼松相近，但对IgM的下调作用不明显;槐杞黄与泼尼松联用与未治疗的肾病生理盐水组无差异，提示在极严重肾病情况下，两者联用对亢进的体液免疫功能没有明显的调低作用。王紫等［2］对IgA肾病模型小鼠应用槐杞黄治疗4周，血清IgA比模型组显著降低，但未达到正常对照组水平，与本研究结果互相支持。槐杞黄可以上调反复呼吸道感染患儿的IgG与IgA［3-4］，反复呼吸道感染患儿体液免疫功能低下，槐杞黄可起到增强免疫力的作用。结合本研究结果，笔者认为槐杞黄是一种双向免疫调节剂，在机体体液免疫亢进时可以对体液免疫进行下调;反之，在机体免疫功能低下时，可以对其上调。
国内多个研究在激素治疗儿童肾病综合征的基础上加用槐杞黄颗粒，发现与单用激素治疗的对照组相比，联合用药组 IgG［5-8］、IgA［5-7］及 IgM［5-6］均显著升高，CD3、CD4均增高［5-6，8-9］，CD8下降［5-6，9］，NK升高［6］。这些研究认为槐杞黄增强了人体的体液及细胞免疫功能，对治疗肾病有益。本研究发现泼尼松及槐杞黄单独应用时都可将过高的体液免疫水平调节至正常或接近正常。两者联用时，结果与上述研究相似但结论不同:两药联用IgA、IgG、IgM均显著高于泼尼松单独应用，但在肾病大鼠中这代表未能将病态的、过高的体液免疫水平下调。阿霉素肾病大鼠处于体液免疫亢进的状态，单独应用槐杞黄起免疫抑制作用。笔者推测槐杞黄在与泼尼松联用时，由于泼尼松属于免疫抑制剂，将亢进的体液免疫状态调低，此时槐杞黄则发挥上调免疫功能的作用，因此表现出与激素拮抗的结果。结合槐杞黄与泼尼松联用的大鼠死亡率、尿蛋白的增长量，以及对体液免疫的调节作用，推测对于极严重的肾病大鼠，槐杞黄与泼尼松联用可能出现互相拮抗的作用，需要分时段使用或避免两者联用。本研究的淋巴细胞亚群分析5组之间未发现明显差异，可能是由于各组样本量过少，需要增加样本量进一步研究。
综上所述，在极严重肾病SD大鼠中，槐杞黄单独应用时能将过高的体液免疫水平下调到正常或接近正常，对IgA及IgG的治疗效果与泼尼松无差异;槐杞黄是一种双向免疫调节剂，与泼尼松联用可能存在拮抗作用，需要分时段使用或避免联用。由于动物病情过重，以及例数较少，未发现治疗或未治疗的肾病大鼠各组间细胞免疫以及尿蛋白增长量的差异，需要进一步增加样本量并制备病情较轻的肾病模型进一步研究。
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Effects of Huai Qi Huang Granules on Immune Function of Adriamycin Nephrosis Rats with Massive Proteinuria
WANG Wei，RU Ying，SONG Hong-mei，LIAN Dong-mei
Department of Pediatrics，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100730，China
【Abstract】Objective To investigate the effects of Huai Qi Huang granules administered alone or combined with predisone on humoral immunity，cellular immunity，and proteinuria of adriamycin nephrosis rats．Methods A total of 50 SD rats were randomly divided into 5 groups(all n=10)，in which 4 groups were injected with a single dose of 6.5 mg/kg adriamycin into the caudal vein to establish nephrosis model，while the other group was injected with normal saline(NS)as normal control．Two weeks later，the nephrosis rat model was established successfully．The rats were treated by daily intragastric administration for 6 weeks:the normal control group(group A)and the nephrosis+NS group(group B)were treated with 2 ml NS;group C(nephrosis+predisone group)，D(nephrosis+Huai Qi Huang group)，and E(nephrosis+predisone+Huai Qi Huang group)were treated with 2 mg/kg prednisone，2 g/kg Huai Qi Huang granule solution，and 2 mg/kg prednisone plus 2 g/kg Huai Qi Huang granule solution，respectively．The 5 groups were compared in terms of death rate，weight changes trend，24-hour urinary protein increment，serum IgA，IgG and IgM，and percentages of lymphocyte subsets of CD3+T cells，CD3+CD4+T cells，CD3+CD8+T cells，CD45RA+B cells，CD161a+NK cells．Results All nephrosis rats model were successfully made，with 24-hour urinary protein being(0.389± 0.273)g/24 h．The death rates of group C and group E were significantly higher than those of group A and group B(P＜0.05)，while no significant difference was found among group C，group D，and group E．The body weight of group A was sustainably growing;in contrast，the body weight of the other 4 groups grew in the 2 weeks before administration of treatment，but dropped thereafter，with no significant difference among the 4 groups．Six weeks after administration，24-hour urinary protein of the 4 nephrosis groups were all increased，by(0.313± 0.266)，(0.404±0.235)，(0.120±0.628)，and(0.480±0.229)g/24 h，respectively，with no signficant difference in increment．There was no significant difference in the percentages of lymphocyte subsets(CD3+T cells，CD3+CD4+T cells，CD3+CD8+T cells，CD45RA+B cells，CD161a+NK cells)among the 5 groups．IgA，IgG，and IgM were higher in group B than in group A;IgA，IgG，and IgM in group C were lower than in group B;in group D，IgA was lower than in group B，IgG lower than in group A and group B，IgM higher than in group A and group C;and in group E，IgA and IgG were higher than in group A，group C and group D，IgM higher than in group A and group C;the differences were all of statistical significance(all P＜0.05)．In addition，there was no significant difference of IgA，IgG，or IgM in the comparison between every other two groups．Conclusions Humoral immunity in severe nephrosis rats is hyperfunctional．Huai Qi Huang is a bidirectional immune modulator．It could down-regulate hyperactive humoral immunity when used alone，similar to the effect of prednisone．When combined with prednisone，it could antagonize the immunosuppression effect of prednisone on the body．No regulation effect of different treatments on cellular immunity or proteinuria was found in this study．
【Key words】Huai Qi Huang;adriamycin nephrosis rats;immunoregulation;prednisone;antagonism effect
Corresponding author：SONG Hong-meiTel:010-69156271，E-mail:songhm1021@hotmail．com
【中图分类号】R967 【
文献标志码：】A 【
文章编号：】1674-9081(2015)05-0343-05
DOI：10.3969/j.issn.1674-9081.2015.05.006
(收稿日期：2014-08-13)
通信作者：宋红梅 电话:010-69156271，E-mail:songhm1021@hotmail．com
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