黄 蕾**,杨利凤,唐 莲,戴 凡,姚文娟
(江苏省炎症与分子药靶重点实验室,南通大学药学院药理系,江苏226001)
[摘 要] Rho相关激酶(Rho-associated kinase,ROCK)ROCK1与ROCK2蛋白是第一批发现的Rho效应蛋白,最早被认为在RhoA介导的张力纤维的形成以及黏着斑的组成中起作用。后来研究发现ROCK可以通过磷酸化活化众多下游靶点,包括肌动蛋白和中间纤维丝蛋白,从而调节这些蛋白的功能。因此,ROCK可调节多种关键细胞功能,包括细胞增殖,迁移和活性。在此综述中,主要讨论ROCK活性调节、相关底物以及在细胞增殖、迁移中的作用。
[关键词] Rho相关激酶;磷酸化;细胞增殖;细胞迁移
丝氨酸/苏氨酸激酶(Rho-associated kinase,ROCK)家族包括ROCK1和ROCK2[1]。ROCK蛋白分子量在160kDa左右,属于系统发育中保存的酶类,与多细胞生物的强直性肌营养不良激酶(myotonic dystrophy kinase,DMPK)、DMPK相关细胞分裂控制蛋白Cdc42和枸橼激酶同源[2]。
ROCK1和ROCK2基因包含33个外显子,各自位于18q11和2p24染色体区域[1]。ROCK2除了全长转录体外,还有一种剪接突变体(mROCK2)。mROCK2在外显子27与28之间存在额外的外显子27',它的基因产物仍保留着ROCK活性,仅有微小的差别[2]。此外,一个5位外显子缺失的ROCK1假基因,被称之为小ROCK,似是部分基因复制的产物,只在血管平滑肌细胞的染色体18p11中表达[3]。
ROCK蛋白65%的氨基酸序列相同,它们的激酶区域92%相同[1]。ROCK蛋白结构组成包括N末端激酶区域以及包含RBD(Rho结合区域)的卷曲螺旋区域[4],在C末端有一个PH结构域(血小板-白细胞C激酶底物同源性结构域),位于内部半胱氨酸丰富区域的侧面,功能未知[5-7]。C末端包括RBD和PH结构域,是一个自动抑制区域,在正常条件下,通过内部分子缔合来抑制激酶活性[6-7]。研究发现,ROCK蛋白同源的N末端激酶结构域可以提高自身磷酸化作用,推测蛋白二聚化作用可以提高ROCK活性[8]。
从胚胎发育到成年小鼠组织中均有ROCK蛋白的表达。ROCK1 mRNA和蛋白在肺、肝、脾、肾和睾丸中高表达[7-9],ROCK2在脑和心脏中高表达[8-9]。ROCK2主要集中在细胞质中,与vimentin和actin张力纤维有关[9]。它也通过C末端区域定位于质膜上[10]。mROCK2蛋白与ROCK2有相似的细胞定位,唯一不同的是mROCK2蛋白不能与质膜相关联[2]。相反,ROCK1的细胞分布并不很清楚。大量研究表明,ROCK1主要定位于内皮细胞的质膜上[11]。ROCK1通过与E-钙粘连蛋白的支架蛋白P120-连环蛋白结合,间接作用于上皮-钙粘连蛋白复合物[12]。此外,ROCK1可集中于微管组织中心以及运动细胞的伪足边缘,说明ROCK1与细胞迁移有关[13]。
Rho-GTP酶超家族中的Rho蛋白(~21kDa)包含RhoA、RhoB和RhoC,这些是研究最多的ROCK调节子[14]。这3种Rho蛋白的GTP结合活化形式都可以与ROCK的RBD区域结合,通过诱导构象改变解除C端介导的自动抑制从而暴露激酶结构域,来增强ROCK的催化活性[14]。此外,内在的Rho活性受到多种辅助蛋白的精密调节,从而影响ROCK的活性。相反,Rho-GTP酶Gem和RhoE经由一个未明确的机制减少ROCK1的活性,Rho-GTP酶Rad通过与ROCK2结合来抑制ROCK2的活性[12-14]。研究还发现几种不依赖于Rho的ROCK调节途径:例如,脂质特别是花生四烯酸刺激能促进不依赖于Rho的ROCK活性,这表明磷脂结合可以改变ROCK的构象,从而使激酶区域暴露而活化[13-14]。ROCK蛋白C末端和N末端激酶区在空间上的相关性导致活性受到抑制。研究发现C末端截短突变或者在细胞凋亡时caspase-3介导ROCK1 C端裂解可以增加ROCK1的活性,颗粒蛋白酶B介导的ROCK2 C末端裂解可以提高ROCK2的活性[13]。
ROCK蛋白磷酸化大量的下游靶点,例如改变F-actin(丝状肌动蛋白)结构组成,从而影响细胞收缩力、能动性及形态。ROCK1和ROCK2可能具有不同的上游信号,但它们的底物都包括肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC),LIM(Lin-11 Isl-1 Mec-3)激酶(LIMK),埃兹蛋白/根连蛋白/膜突蛋白(Ezrin/Radixin/Moesin,ERM)和中间丝蛋白质类,大部分情况下底物被各自的ROCK蛋白磷酸化,但是对于高度同源,尤其是激酶区域同源的两个家族成员都可以被任一ROCK蛋白磷酸化。底物大部分都被磷酸化在氨基酸特定的序列上:K/R-X-S/T或K/ R-XX-S/T(X是任何一个氨基酸)[15-16],因此,ROCK底物分成3组:(1)肌动蛋白相关;(2)中间丝蛋白类;(3)其它。
4.1 肌球蛋白轻链 肌球蛋白Ⅱ是一个多亚单位蛋白复合体,具有调节肌动、肌球蛋白介导细胞收缩的催化活性。MLC1和2都是肌球蛋白Ⅱ催化区域的核心蛋白,可调节肌球蛋白ATP酶活性,从而干扰丝状肌动蛋白,调节细胞收缩。如MLC2的磷酸化可提高肌球蛋白Ⅱ的ATP酶活性从而增强细胞收缩,而其磷酸化主要取决于Ca2+,依赖的MLC激酶(MLC kinase,MLCK)和MLC磷酸酶(MLC phosphatase,MYPT)之间的平衡。最近越来越多的证据表明,MLC的磷酸化也可不依赖于Ca2+浓度,而是被ROCK2磷酸化,但是在Ca2+缺乏时仍然是MLCK占主导地位,Rho-ROCK的激活只会导致少量的MLC磷酸化[15-16]。
4.2 肌球蛋白结合亚单位 MYPT是一个异源三聚体复合物,可调节MYPT靶向作用于肌球蛋白结合亚单位(myosin-binding subunit,MBS),这是一个具有磷酸酶催化活性的1c亚单元,以及一个未知功能的M20亚单元。在早期体外研究中,MBS被认为是ROCK2的底物[17]。MBS的磷酸化可抑制MYPT的催化活性,从而诱导MLC的磷酸化和肌球蛋白ATP酶活性,因此,ROCK信号通路通过直接的磷酸化和抑制其去磷酸化作用使MLC磷酸化得到两倍的增强。
4.3 LIMK LIMK家族成员包括LIMK1和LIMK2,都是丝氨酸/苏氨酸激酶,可通过磷酸化和抑制肌动蛋白解聚因子cofilin的活性来调节肌动蛋白运动。ROCK1和ROCK2可分别在Thr 508和Thr 505位点磷酸化LIMK1和LIMK2,从而促进它们的激活。它们激活后,LIMKs在高度保守的丝氨酸3位点上磷酸化cofilin,从而阻止它与F-actin的结合,抑制肌动蛋白的解聚和肌动蛋白丝的断裂,促进细胞内F-actin网状结构的增强[18]。LIMKs也可以被p-21-活化的激酶PAK1和PKA4激活,而它们是Rho-GTP酶Rac和Cdc42的下游靶蛋白。
4.4 ERM ERM复合体是F-actin和质膜相连的锚定蛋白,在肌动蛋白的迅速运动及细胞骨架重排中发挥重要作用。在体外细胞研究中,根连蛋白(radixin)、膜突蛋白(moesin)和埃兹蛋白(Ezrin)都是ROCK2的底物[18-19],这提示ROCK2磷酸化ERM复合物可增强它们与细胞内分子的相互作用,并且使它们在细胞质膜上重新分布来增强ERM活性。当然,ERM也可被其它激酶磷酸化,包括蛋白激酶C-θ、DMPK相关的MRCK和淋巴细胞定位激酶。ERM磷酸化会导致三聚体亲和力的增强,使细胞迁移减少[19]。ROCK底物之一的MYPT也表现出对膜突蛋白的磷酸酶活性,因此推测ROCK也可通过磷酸化ERM,从而引起ERM活性增强,发挥在调节细胞骨架中的重要作用。
4.5 中间纤维丝蛋白 中间纤维丝蛋白(IFs)由四个寡聚体蛋白IF聚合组成,以一个非平行方式相互作用组成非极性的纤维丝结构。大部分的IF蛋白都是角蛋白,然而也存在一大类非角蛋白的IF蛋白,它们共有保守的中心ɑ螺旋棒状结构域和高度可变的非ɑ螺旋末端[20]。IF网状结构赋予细胞张力,这对许多细胞进程包括迁移和增殖都很重要。四种IF都是已知的ROCK底物,包括结蛋白、波形蛋白、神经胶质纤维酸性蛋白与神经纤维丝-L。结蛋白亚单元形成IFs,分布在骨骼肌、平滑肌和心肌肌节的Z线上,它是肌细胞骨架的重要结构组份,在结蛋白敲除小鼠中,会出现明显的肌肉萎缩和衰退[20-21]。结蛋白在体外可被ROCK2磷酸化,导致IF组装受到抑制[21]。同时,ROCK2还可介导波形蛋白磷酸化作用,而且神经胶质纤维酸性蛋白也是ROCK2的底物,其磷酸化对无错误的胞质分裂是必需的[22]。
真核细胞的分裂周期是一个基础的生物学过程,它需要非常精准分子活动来保证DNA的准确度和维持细胞稳态。有研究表明ROCK蛋白在调节细胞增殖中发挥作用,在细胞增殖G1/S期以及有丝分裂过程中ROCK被活化。过表达或活化ROCK1或ROCK2可引起细胞增殖。此外,ROCK活化可诱导β-catenin及其转录靶点c-myc的表达升高,增强细胞株和小鼠表皮细胞的增殖,抑制ROCK活力会延迟胞质分裂,也会促进G1期中心粒的异常分离,从而在有丝分裂过程中出现过早的中心体迁移,表明ROCK活性在细胞周期的调节中起着重要的作用[23]。
细胞周期G1期是一个限制性节点,这一时期可以评价DNA的完整性以及确定一个细胞是否处于细胞周期循环,抑或是恢复到静止的G0期。在NIH-3T3成纤维细胞中异位的ROCK表达可以刺激细胞S期的进程,并且增加G1/S期依赖的细胞周期蛋白(cyclin)D1的水平[24]。相反,在角膜上皮细胞中抑制ROCK活性会削弱G1/S期的转变,这也在心肌细胞中得到了验证,抑制ROCK可以减少cyclin D3以及周期蛋白依赖的激酶(CDK)6和P27的表达[24-25]。
此外,在胞质分裂时ROCK蛋白活化会导致富有肌动蛋白的分裂沟的形成,同时伴随着在分裂沟下的IF的分解。抑制ROCK活性会延迟子代细胞的分裂[25],表明ROCK活性的精确调节对于细胞分裂的完成很重要。而且几种ROCK底物都参与细胞增殖的调控,更加证明ROCK信号在细胞生长调节中的重要作用。
细胞迁移包括一些能使细胞向前运动的重要事件,这些事件包括通过伪足产生而形成的细胞极化,伪足上有富含肌动蛋白与微管蛋白的“路径”结构,通过与黏附复合体结合而固定于基质上。此外,肌动-肌球蛋白介导细胞收缩也是重要事件之一,它能使细胞向前运动。Rho-ROCK信号通路对细胞迁移的作用会因所使用的细胞株不同而不同。用干扰RNA或抑制剂Y27632抑制ROCK1和ROCK2的活性,会减少单核细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞,人脐静脉内皮细胞、平滑肌细胞、胚胎滋养层细胞和前列腺细胞的迁移,而对宫颈癌细胞HELA和非洲绿猴肾细胞Vero无影响[26-28]。有研究显示,减少ROCK1表达能增强巨噬细胞和中性粒白细胞的迁移[29]。尽管ROCK蛋白被认为是肌动-肌球蛋白介导细胞收缩的诱导物,但是ROCK对单核细胞和前列腺细胞的迁移却不依赖于这个过程。
几种ROCK底物参与其调节细胞迁移以及迁移相关的特征,因为这些底物的磷酸化诱导了细胞的形态改变,与迁移细胞表型一致,所以ROCK可能增强大部分细胞的迁移。但是,迄今为止的研究大多集中于使用小分子抑制剂,它们对两种ROCK蛋白的活性都有抑制作用。为进一步深入研究ROCK蛋白在细胞迁移中的作用,需要对单个的ROCK蛋白进行过表达或敲除,观察对细胞迁移行为的影响。
[参考文献]
[1]Pan P,Shen M,Yu H,et al.Advences in the development of Rho-associated protein kinase(ROCK)inhibitors[J].Drug Discov Today,2013,18(23-24):1323-1333.
[2]Pelosi M,Marampon F,Zani BM,et al.ROCK2 and its alternatively spliced isoform ROCK2m positively control the maturation of the myogenic program[J].Mol Cell Biol,2007,27(17):6163-6176.
[3]Montefusco MC,Merlo K,Bryan CD,et al.Little Rock is a ROCK1 pseudogene expressed in human smooth muscle cells[J].BMC Genet,2010,11(1):22-30.
[4]Tu D,Li Y,Song HK,et al.Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK I[J].PLoS One,2011,6(3):e18080.
[5]Duong-Quy S,Bei Y,Liu Z,et al.Role of Rho-kinase and its inhibitors in pulmonary hypertension[J].Pharmacol Ther,2013,137(3):352-364.
[6]Cao Z,Li X,Li J,et al.SUMOylation of RhoGDIα is required for its repression of cyclin D1 expression and anchorage-independent growth of cancer cells[J].Mol Oncol,2014,8(2):285-296.
[7]Forgione N,Fehlings MG.Rho-ROCK inhibition in the treatment of spinal cord injury[J].World Neurosurg,2014,82(3/4):E535-E539.
[8]Garg R,Riento K,Keep N,et al.N-terminus-mediated dimerization of ROCK-1 is required for RhoE binding and actin reorganization[J].Biochemical Journal,2008,411(2):407-414.
[9]Bauer PO,Hudec R,Goswami A,et al.ROCK-phosphorylated vimentin modifies mutant huntingtin aggregation via sequestration of IRBIT[J].Mol Neurodegener,2012,7:43.
[10]Kher SS,Worthylake RA.Regulation of ROCKII membrane localization through its C-terminus[J].Exp Cell Res,2011,317(20):2845-2852.
[11]Ishiuchi T,Takeichi M.Willin and Par3 cooperatively regulate epithelial apical constriction through aPKC-mediated ROCK phosphorylation[J].Nat Cell Biol,2011,13(7):860-866.
[12]Smith AL,Dohn MR,Brown MV.Association of Rho-associated protein kinase 1 with E-cadherin complexes is mediated by p120-catenin[J].Mol Biol Cell,2012,23(1):99-110.
[13]Farber MJ,Rizaldy R,Hildebrand JD.Shroom2 regulates contractility to control endothelial morphogenesis[J].Mol Biol Cell,2011,22(6):795-805.
[14]Boureux A,Vignal E,Faure S,et al.Evolution of the Rho family of ras-like GTPases in eukaryotes[J].Mol Biol Evol,2007,24(1):203-216.
[15]Kang JH,Jiang Y,Toit R,et al.Phosphorylation of Rho-associated kinase(Rho-Kinase/ROCK/ROK)substrates by protein kinases A and C[J].Biochimie,2007,89(1):39-47.
[16]Kang JH,Asai D,Tsuchiya A,et al.Peptide substrates for Rho-Associated kinase 2(Rho-Kinase 2/ROCK2)[J]. PLoS One,2011,6(7):e22699.
[17]Kawanami D,Matoba K,Okada R,et al.Fasudil inhibits ER stress-induced VCAM-1 expression by modulating unfolded protein response in endothelial cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,435(2):171-175.
[18]Shi J,Wu X,Surma M,et al.Distinct roles for ROCK1 and ROCK2 in the regulation of cell detachment[J].Cell Death Dis,2013,4:e483.
[19]Belkina NV,Liu Y,Hao JJ,et al.LOK is a major ERM kinase in resting lymphocytes and regulates cytoskeletal rearrangement through ERM phosphorylation[J].Proc Natl A-cad Sci U S A,2009,106(12):4707-4712.
[20]Lee CH,Kim MS,Chung BM,et al.Structural basis for heteromeric assembly and perinuclear organization of keratin filaments[J].Nat Struct Mol Biol,2012,19(7):707-715.
[21]Wang CH,Wu CC,Hsu SH,et al.The role of RhoA kinase inhibition in human placenta-derived multipotent cells on neural phenotype and cell survival[J].Biomaterials,2013,34(13):3223-3230.
[22]Yang X,Liu Y,Liu C,et al.Inhibition of ROCK2 expression protects against methamphetamine-induced neurotoxicity in PC12 cells[J].Brain Res,2013,1533:16-25.
[23]Samuel MS,Lopez JI,Mcghee EJ,et al.Actomyosin-mediated cellular tension drives increased tissue stiffness and β-catenin activation to induce epidermal hyperplasia and tumor growth[J].Cancer Cell,2011,19(6):776-791.
[24]Chen J,Guerriero E,Lathrop K,et al.Rho/ROCK signaling in regulation of corneal epithelial cell cycle progression[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci,2008,49(1):175-183.
[25]Zhao Y,Lv M,Lin HS,et al.Rho-associated protein kinase isoforms stimulate proliferation of vascular smooth muscle cells through ERK and induction of cyclin D1 and PCNA[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,432(3):488-493.
[26]Zhang JB,He XE,Ma YE,et al.Overexpression of ROCK1 and ROCK2 inhibits human laryngeal squamous cell carcinoma[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(1):244-251.
[27]Saso J,Shields SK,Zuo YF,et al.Role of Rho GTPases in human trophoblast migration induced by IGFBP1[J].Biol Reprod,2012,86(1):1-9.
[28]Nakayama M,Goto TM,Sugimoto MA,et al.Rho-kinase phosphorylates PAR-3 and disrupts PAR complex formation[J].Dev Cell,2008,14(2):205-215.
[29]Vemula S,Shi J,Hanneman P,et al.ROCK1 functions as a suppressor of inflammatory cell migration by regulating PTEN phosphorylation and stability[J].Blood,2010,115(9):1785-1796.
[中图分类号] R329.2+8
[文献标志码]B
[收稿日期] 2016-09-28
[文章编号]1006-2440(2017)01-0024-04
*[基金项目] 南通大学研究生科研创新计划项目(YKC16057);南通市科技计划项目(MS12015048);江苏省高校自然科学研究计划(16KJB360007)。
**[作者简介]黄蕾,女,汉族,江苏南通人,生于1992年2月,硕士研究生,研究方向:心血管药理。通信作者:姚文娟,E-mail:juanwenyy@ntu. edu.cn
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