黄 蕾**，杨利凤，唐 莲，戴 凡，姚文娟
（江苏省炎症与分子药靶重点实验室，南通大学药学院药理系，江苏226001）
[摘 要] Rho相关激酶（Rho-associated kinase，ROCK）ROCK1与ROCK2蛋白是第一批发现的Rho效应蛋白，最早被认为在RhoA介导的张力纤维的形成以及黏着斑的组成中起作用。后来研究发现ROCK可以通过磷酸化活化众多下游靶点，包括肌动蛋白和中间纤维丝蛋白，从而调节这些蛋白的功能。因此，ROCK可调节多种关键细胞功能，包括细胞增殖，迁移和活性。在此综述中，主要讨论ROCK活性调节、相关底物以及在细胞增殖、迁移中的作用。
[关键词] Rho相关激酶；磷酸化；细胞增殖；细胞迁移
丝氨酸/苏氨酸激酶（Rho-associated kinase，ROCK）家族包括ROCK1和ROCK2[1]。ROCK蛋白分子量在160kDa左右，属于系统发育中保存的酶类，与多细胞生物的强直性肌营养不良激酶（myotonic dystrophy kinase，DMPK）、DMPK相关细胞分裂控制蛋白Cdc42和枸橼激酶同源[2]。
ROCK1和ROCK2基因包含33个外显子，各自位于18q11和2p24染色体区域[1]。ROCK2除了全长转录体外，还有一种剪接突变体（mROCK2）。mROCK2在外显子27与28之间存在额外的外显子27＇，它的基因产物仍保留着ROCK活性，仅有微小的差别[2]。此外，一个5位外显子缺失的ROCK1假基因，被称之为小ROCK，似是部分基因复制的产物，只在血管平滑肌细胞的染色体18p11中表达[3]。
ROCK蛋白65%的氨基酸序列相同，它们的激酶区域92%相同[1]。ROCK蛋白结构组成包括N末端激酶区域以及包含RBD（Rho结合区域）的卷曲螺旋区域[4]，在C末端有一个PH结构域（血小板-白细胞C激酶底物同源性结构域），位于内部半胱氨酸丰富区域的侧面，功能未知[5-7]。C末端包括RBD和PH结构域，是一个自动抑制区域，在正常条件下，通过内部分子缔合来抑制激酶活性[6-7]。研究发现，ROCK蛋白同源的N末端激酶结构域可以提高自身磷酸化作用，推测蛋白二聚化作用可以提高ROCK活性[8]。
从胚胎发育到成年小鼠组织中均有ROCK蛋白的表达。ROCK1 mRNA和蛋白在肺、肝、脾、肾和睾丸中高表达[7-9]，ROCK2在脑和心脏中高表达[8-9]。ROCK2主要集中在细胞质中，与vimentin和actin张力纤维有关[9]。它也通过C末端区域定位于质膜上[10]。mROCK2蛋白与ROCK2有相似的细胞定位，唯一不同的是mROCK2蛋白不能与质膜相关联[2]。相反，ROCK1的细胞分布并不很清楚。大量研究表明，ROCK1主要定位于内皮细胞的质膜上[11]。ROCK1通过与E-钙粘连蛋白的支架蛋白P120-连环蛋白结合，间接作用于上皮-钙粘连蛋白复合物[12]。此外，ROCK1可集中于微管组织中心以及运动细胞的伪足边缘，说明ROCK1与细胞迁移有关[13]。
Rho-GTP酶超家族中的Rho蛋白（～21kDa）包含RhoA、RhoB和RhoC，这些是研究最多的ROCK调节子[14]。这3种Rho蛋白的GTP结合活化形式都可以与ROCK的RBD区域结合，通过诱导构象改变解除C端介导的自动抑制从而暴露激酶结构域，来增强ROCK的催化活性[14]。此外，内在的Rho活性受到多种辅助蛋白的精密调节，从而影响ROCK的活性。相反，Rho-GTP酶Gem和RhoE经由一个未明确的机制减少ROCK1的活性，Rho-GTP酶Rad通过与ROCK2结合来抑制ROCK2的活性[12-14]。研究还发现几种不依赖于Rho的ROCK调节途径：例如，脂质特别是花生四烯酸刺激能促进不依赖于Rho的ROCK活性，这表明磷脂结合可以改变ROCK的构象，从而使激酶区域暴露而活化[13-14]。ROCK蛋白C末端和N末端激酶区在空间上的相关性导致活性受到抑制。研究发现C末端截短突变或者在细胞凋亡时caspase-3介导ROCK1 C端裂解可以增加ROCK1的活性，颗粒蛋白酶B介导的ROCK2 C末端裂解可以提高ROCK2的活性[13]。
ROCK蛋白磷酸化大量的下游靶点，例如改变F-actin（丝状肌动蛋白）结构组成，从而影响细胞收缩力、能动性及形态。ROCK1和ROCK2可能具有不同的上游信号，但它们的底物都包括肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC），LIM（Lin-11 Isl-1 Mec-3）激酶（LIMK），埃兹蛋白/根连蛋白/膜突蛋白（Ezrin/Radixin/Moesin，ERM）和中间丝蛋白质类，大部分情况下底物被各自的ROCK蛋白磷酸化，但是对于高度同源，尤其是激酶区域同源的两个家族成员都可以被任一ROCK蛋白磷酸化。底物大部分都被磷酸化在氨基酸特定的序列上：K/R-X-S/T或K/ R-XX-S/T（X是任何一个氨基酸）[15-16]，因此，ROCK底物分成3组：（1）肌动蛋白相关；（2）中间丝蛋白类；（3）其它。
4.1 肌球蛋白轻链 肌球蛋白Ⅱ是一个多亚单位蛋白复合体，具有调节肌动、肌球蛋白介导细胞收缩的催化活性。MLC1和2都是肌球蛋白Ⅱ催化区域的核心蛋白，可调节肌球蛋白ATP酶活性，从而干扰丝状肌动蛋白，调节细胞收缩。如MLC2的磷酸化可提高肌球蛋白Ⅱ的ATP酶活性从而增强细胞收缩，而其磷酸化主要取决于Ca2+，依赖的MLC激酶（MLC kinase，MLCK）和MLC磷酸酶（MLC phosphatase，MYPT）之间的平衡。最近越来越多的证据表明，MLC的磷酸化也可不依赖于Ca2+浓度，而是被ROCK2磷酸化，但是在Ca2+缺乏时仍然是MLCK占主导地位，Rho-ROCK的激活只会导致少量的MLC磷酸化[15-16]。
4.2 肌球蛋白结合亚单位 MYPT是一个异源三聚体复合物，可调节MYPT靶向作用于肌球蛋白结合亚单位（myosin-binding subunit，MBS），这是一个具有磷酸酶催化活性的1c亚单元，以及一个未知功能的M20亚单元。在早期体外研究中，MBS被认为是ROCK2的底物[17]。MBS的磷酸化可抑制MYPT的催化活性，从而诱导MLC的磷酸化和肌球蛋白ATP酶活性，因此，ROCK信号通路通过直接的磷酸化和抑制其去磷酸化作用使MLC磷酸化得到两倍的增强。
4.3 LIMK LIMK家族成员包括LIMK1和LIMK2，都是丝氨酸/苏氨酸激酶，可通过磷酸化和抑制肌动蛋白解聚因子cofilin的活性来调节肌动蛋白运动。ROCK1和ROCK2可分别在Thr 508和Thr 505位点磷酸化LIMK1和LIMK2，从而促进它们的激活。它们激活后，LIMKs在高度保守的丝氨酸3位点上磷酸化cofilin，从而阻止它与F-actin的结合，抑制肌动蛋白的解聚和肌动蛋白丝的断裂，促进细胞内F-actin网状结构的增强[18]。LIMKs也可以被p-21-活化的激酶PAK1和PKA4激活，而它们是Rho-GTP酶Rac和Cdc42的下游靶蛋白。
4.4 ERM ERM复合体是F-actin和质膜相连的锚定蛋白，在肌动蛋白的迅速运动及细胞骨架重排中发挥重要作用。在体外细胞研究中，根连蛋白（radixin）、膜突蛋白（moesin）和埃兹蛋白（Ezrin）都是ROCK2的底物[18-19]，这提示ROCK2磷酸化ERM复合物可增强它们与细胞内分子的相互作用，并且使它们在细胞质膜上重新分布来增强ERM活性。当然，ERM也可被其它激酶磷酸化，包括蛋白激酶C-θ、DMPK相关的MRCK和淋巴细胞定位激酶。ERM磷酸化会导致三聚体亲和力的增强，使细胞迁移减少[19]。ROCK底物之一的MYPT也表现出对膜突蛋白的磷酸酶活性，因此推测ROCK也可通过磷酸化ERM，从而引起ERM活性增强，发挥在调节细胞骨架中的重要作用。
4.5 中间纤维丝蛋白 中间纤维丝蛋白（IFs）由四个寡聚体蛋白IF聚合组成，以一个非平行方式相互作用组成非极性的纤维丝结构。大部分的IF蛋白都是角蛋白，然而也存在一大类非角蛋白的IF蛋白，它们共有保守的中心ɑ螺旋棒状结构域和高度可变的非ɑ螺旋末端[20]。IF网状结构赋予细胞张力，这对许多细胞进程包括迁移和增殖都很重要。四种IF都是已知的ROCK底物，包括结蛋白、波形蛋白、神经胶质纤维酸性蛋白与神经纤维丝-L。结蛋白亚单元形成IFs，分布在骨骼肌、平滑肌和心肌肌节的Z线上，它是肌细胞骨架的重要结构组份，在结蛋白敲除小鼠中，会出现明显的肌肉萎缩和衰退[20-21]。结蛋白在体外可被ROCK2磷酸化，导致IF组装受到抑制[21]。同时，ROCK2还可介导波形蛋白磷酸化作用，而且神经胶质纤维酸性蛋白也是ROCK2的底物，其磷酸化对无错误的胞质分裂是必需的[22]。
真核细胞的分裂周期是一个基础的生物学过程，它需要非常精准分子活动来保证DNA的准确度和维持细胞稳态。有研究表明ROCK蛋白在调节细胞增殖中发挥作用，在细胞增殖G1/S期以及有丝分裂过程中ROCK被活化。过表达或活化ROCK1或ROCK2可引起细胞增殖。此外，ROCK活化可诱导β-catenin及其转录靶点c-myc的表达升高，增强细胞株和小鼠表皮细胞的增殖,抑制ROCK活力会延迟胞质分裂，也会促进G1期中心粒的异常分离，从而在有丝分裂过程中出现过早的中心体迁移，表明ROCK活性在细胞周期的调节中起着重要的作用[23]。
细胞周期G1期是一个限制性节点，这一时期可以评价DNA的完整性以及确定一个细胞是否处于细胞周期循环，抑或是恢复到静止的G0期。在NIH-3T3成纤维细胞中异位的ROCK表达可以刺激细胞S期的进程，并且增加G1/S期依赖的细胞周期蛋白（cyclin）D1的水平[24]。相反，在角膜上皮细胞中抑制ROCK活性会削弱G1/S期的转变，这也在心肌细胞中得到了验证，抑制ROCK可以减少cyclin D3以及周期蛋白依赖的激酶（CDK）6和P27的表达[24-25]。
此外，在胞质分裂时ROCK蛋白活化会导致富有肌动蛋白的分裂沟的形成，同时伴随着在分裂沟下的IF的分解。抑制ROCK活性会延迟子代细胞的分裂[25]，表明ROCK活性的精确调节对于细胞分裂的完成很重要。而且几种ROCK底物都参与细胞增殖的调控，更加证明ROCK信号在细胞生长调节中的重要作用。
细胞迁移包括一些能使细胞向前运动的重要事件，这些事件包括通过伪足产生而形成的细胞极化，伪足上有富含肌动蛋白与微管蛋白的“路径”结构，通过与黏附复合体结合而固定于基质上。此外，肌动-肌球蛋白介导细胞收缩也是重要事件之一，它能使细胞向前运动。Rho-ROCK信号通路对细胞迁移的作用会因所使用的细胞株不同而不同。用干扰RNA或抑制剂Y27632抑制ROCK1和ROCK2的活性，会减少单核细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞，人脐静脉内皮细胞、平滑肌细胞、胚胎滋养层细胞和前列腺细胞的迁移，而对宫颈癌细胞HELA和非洲绿猴肾细胞Vero无影响[26-28]。有研究显示，减少ROCK1表达能增强巨噬细胞和中性粒白细胞的迁移[29]。尽管ROCK蛋白被认为是肌动-肌球蛋白介导细胞收缩的诱导物，但是ROCK对单核细胞和前列腺细胞的迁移却不依赖于这个过程。
几种ROCK底物参与其调节细胞迁移以及迁移相关的特征，因为这些底物的磷酸化诱导了细胞的形态改变，与迁移细胞表型一致，所以ROCK可能增强大部分细胞的迁移。但是，迄今为止的研究大多集中于使用小分子抑制剂，它们对两种ROCK蛋白的活性都有抑制作用。为进一步深入研究ROCK蛋白在细胞迁移中的作用，需要对单个的ROCK蛋白进行过表达或敲除，观察对细胞迁移行为的影响。
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[中图分类号] R329.2+8
[文献标志码]B
[收稿日期] 2016-09-28
［文章编号］1006-2440（2017）01-0024-04
*[基金项目] 南通大学研究生科研创新计划项目（YKC16057）；南通市科技计划项目（MS12015048）；江苏省高校自然科学研究计划（16KJB360007）。
**[作者简介]黄蕾，女，汉族，江苏南通人，生于1992年2月，硕士研究生，研究方向：心血管药理。通信作者：姚文娟，E-mail:juanwenyy@ntu. edu.cn
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