·论著与基础研究·
蒯小玲**，张健峰，易楠，曹维，季易斐，毛振彪
（南通大学附属医院消化内科，江苏 226001）
[摘要] 目的：探索独立生长因子1（growth factor-independent 1，Gfi-1）在胃癌组织中的表达以及与病理特征的关系。方法：收集146例胃癌组织样本，采用免疫组化染色检测Gfi-1在胃癌组织及癌旁组织中的表达。结果：Gfi-1主要表达于癌细胞以及间质浸润的炎性细胞的细胞浆中，癌旁组织不表达。Gfi-1的表达与胃癌TNM分期、分化程度、淋巴结转移相关（P<>结论：Gfi-1是胃癌的癌基因，其表达与胃癌病理特征相关。
[关键词] 胃癌；独立生长因子1；病理特征；免疫组织化学
胃癌是起源于胃粘膜上皮的恶性肿瘤，在全球范围内发病位于第四位的肿瘤，但死亡率位于第二位[1]。我国属于胃癌高发国家，每年胃癌新发病例约40万例，每年死亡约30万例，占全世界胃癌新发和死亡病例的40%，严重危害人民健康[2]。
胃癌的发生、发展和转移涉及多种癌基因的活化和抑癌基因的失活，分子机制较为复杂。独立生长因子1（growth factor-independent 1，Gfi-1）是一种核转录抑制因子,属于锌指转录抑制因子，在造血系统发育，红细胞和巨核细胞分化过程中起着重要的作用[3]。Gfi1功能缺乏小鼠中性粒细胞减少，可遗传的Gfi-1突变在人类造成严重的先天性中性粒细胞减少症[4-5]。Gfi-1也是原癌基因，在淋巴瘤和白血病的发生中亦起着重要作用[6-7]。Gfi-1在非血液系统组织分化中亦有调节作用，如肠上皮、内耳细胞、肺神经内分泌细胞[8-10]。研究表明Gfi-1还参与非血液系肿瘤的发生机制，如结肠癌[11]、儿童髓母细胞瘤[12]和淋巴瘤[13]。Gfi-1是一个较新发现的癌基因，在实体肿瘤中的研究报道不多，本研究收集2010年1月—2014年1月南通大学附属医院病理科保存的146例患者行胃癌根治术的标本，探索Gfi-1在胃癌组织中的表达及意义。
1.1 一般资料行胃癌根治术患者146例,男性110例，女性36例，年龄44～81岁，平均64.26±12.52岁，其中60岁以下58例，60岁以上88例。患者术前均未行抗肿瘤治疗并均有完整的随访资料，随访时间3～122月。按第7版美国癌症联合会（AJCC）和国际抗癌联盟（UICC）TNM分期，对胃癌进行临床分期。
1.2 免疫组织化学染色
1.2.1 主要试剂：抗Gfi-1单克隆抗体（Sigma-Aldrich公司，美国，WH0002672M1，1∶100稀释），辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG抗体（Sigma-Aldrich公司，美国，A0168，1∶100稀释），二甲苯、无水乙醇、3%过氧化氢、枸橼酸盐缓冲溶液（pH6.0），磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.2）、0.02%二氨基联苯胺盐酸盐、苏木素（国药集团上海化学试剂公司）。
1.2.2 主要仪器设备：石蜡切片机（Leica公司，德国），显微镜：（Olympus公司，日本）。
1.2.3 免疫组化染色：石蜡组织切片（4μm）经100%二甲苯脱蜡和梯度乙醇进行水化，然后用蒸馏水和PBS洗涤3次。以3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性。切片置于10mmol/L枸橼酸盐缓冲液（pH6）中进行微波抗原修复处理。自然冷却至室温后，PBS洗涤3次。然后加10%山羊血清封闭非特异背景，室温孵育60min，然后滴加抗Gfi-1单克隆抗体，4℃冰箱孵育过夜。将过夜孵育后的切片，在37℃培养箱中再孵育30min，PBS洗涤3次。滴加辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG抗体，在37℃培养箱中孵育30min，PBS洗涤3次。加入新鲜配置的DAB显色液1分20秒，用自来水冲洗，终止反应。切片用苏木素复染、梯度乙醇脱水、中性树胶封片，置于显微镜下观察。每次实验均设阴性对照组和阳性对照组，阴性对照组以PBS代替一抗，以淋巴瘤组织标本作为阳性对照。
1.2.4 染色结果判断：细胞浆中出现棕色颗粒为阳性。所有的免疫组化染色切片，在双盲的方式进行评估，阅片的病理医生并不知道患者的临床和诊断。由两位病理学专家分别使用多头显微镜对切片染色强度和阳性细胞数进行综合评分。随机选择5个区域，至少数1 000个细胞以上，计算阳性细胞表达率。根据阳性细胞表达率计分：高表达组（100%～75%，3分）、中度表达组（50%～75%，2分）和低表达组（＜50%，1分）。根据染色强度计分：低染色评分为1分，中度染色为2分，强染色为3分。阳性细胞表达率计分×染色强度计分得出标本评分，分值为0～4.5定义为低表达，4.5～9定义为高表达。
1.3 统计学处理采用SPSS17.0软件进行统计分析。计量数据以均数±标准差（xˉ±s）表示，采用卡方检验分析Gfi1表达与临床病理特征之间的关系，Kaplan-Meier法进行生存分析。P<>
2.1 Gfi-1在胃癌组织中的表达Gfi-1主要表达于癌细胞以及间质浸润的炎性细胞的细胞浆中，癌旁组织细胞不表达。见图1。
图1 Gfi-1在胃癌组织中的表达
2.2 Gfi-1表达与胃癌临床病理特征的关系Gfi-1在胃癌中的表达与胃癌TNM分期、分化程度、淋巴结转移相关（P<>
表1 Gfi-1表达与胃癌临床病理特征的关系
临床特征例数高表达（%）低表达（%）χ2检验多因素分析χ2值P值HR（95%CI）P值分化程度高、中分化59 30（50.85）29（49.15）7.072 0.0078 1.652（1.125～2.896）0.008低分化87 63（72.41）24（27.59）淋巴结转移无54 12（22.22）42（77.78）19.333 0.00001 1.852（1.492～2.263）0.012有92 55（59.78）37（40.22）TNM分期0和Ⅰ32 10（31.25）22（68.75）10.347 0.00566 2.562（2.126～3.822）0.004
2.3 Gfi-1表达与胃癌患者生存期的关系Kaplan-Meier生存分析结果表明Gfi-1高表达患者的生存期短，见图2。
图2 Gfi-1表达与患者生存期分析表达高生存期短（实线），表达低生存期则长（虚线）
癌基因和抑癌基因一直是肿瘤研究的热点，胃癌的发生、发展和转移是一个多步骤的过程，多种癌基因和抑癌基因参与其中。1993年Gilks等[14]的研究表明Gfi-1参与淋巴瘤的发生，Gfi-1作为潜在癌基因从而被发现。该基因调控细胞生长、分化和迁移。Gfi-1作为转录因子，既可调控造血系统发育，造血干细胞功能维持、红细胞和巨核细胞正常分化[3，15]，但又参与血液系统肿瘤如淋巴瘤和白血病的发生[6-7]。近几年有关于实体肿瘤Gfi-1的研究，但并不多见。Northcott等[12]深入研究137例侵袭性髓母细胞瘤病例，通过全基因组测序发现Gfi-1与儿童髓母细胞瘤有关，在健康脑组织中失活的癌基因Gfi1在这些肿瘤中发生转录，由此促成癌症形成，并提出肿瘤发生过程中基因被“绑架”的新论点。Gfi-1以DNA结合依赖的方式被多种基因激活，所谓被“绑架”基因。Gfi-1通过结合目的基因启动子的保守序列抑制基因转录[16]。在结肠癌和淋巴瘤的研究中均发现Gfi-1与Myc作为协同致癌基因，参与肿瘤细胞的增殖，增加肿瘤的发生[11，13]。目前，尚未见关于胃癌Gfi-1的研究报道，本研究探索Gfi-1在胃癌组织中的表达以及与病理特征之间的关系，为胃癌研究开辟新的研究信号通路。
本研究结果显示，胃癌组织中Gfi-1的表达显著高于癌旁组织，并与胃癌的分期、淋巴结转移和分化程度相关，分期越晚，淋巴结转移和分化差的胃癌表达高，并且表达水平高的患者生存期明显短于表达水平低的患者，表明Gfi-1也是胃癌的癌基因。我们将进一步研究Gfi-1对胃癌细胞的增殖、迁移的影响以及相关的分子通路，由于Gfi-1是多个基因结合的位点，激活后又可影响相关靶基因的表达，值得深入探讨。
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The expression of Gfi-1 in Gastric cancer and its clinical significance
KUAI Xiaoling,ZHANG Jianfeng,YI Nan,CAO Wei,JI Yifei,MAO Zhengbiao
(Department of Gastroenterology,Affiliated Hospital of Nantong University,Jiangsu 226001)
[Abstract] Objective:To investigate the expression of Gfi-1(growth factor-independent 1)in gastric cancer and its correlation with pathological characteristics.Methods:146 gastric cancer tissue samples were collected.The expression of Gfi-1 in gastric cancer tissue and adjacent cancer tissue was detected by immunohistochemistry.SPSS17.0 software was used for Chi-square analysis and Kaplan-Meier survival analysis.Results:Gfi-1 expressed in cytoplasm of gastric cancer cells,and which did not express in adjacent cancer tissue.The expression of Gfi-1 in gastric cancer was correlated with TNM stage,differentiation degree and lymph nodesmetastasis and was negative correlated with survival time.Conclusion:Gfi-1 is oncogene,which expressed in gastric cancer and was correlated with pathological characteristics.
[Key words] gastric cancer;growth factor-independent1;pathological characteristics;immunohistochemistry
[中图分类号] R735.2
[文献标志码]A
［文章编号］1006-2440（2016）06-0553-04
[收稿日期] 2016-10-11
*[基金项目] 江苏省卫计委资助项目（Z201306）；江苏省六大人才高峰项目（WS-055）。
**[作者简介]蒯小玲，女，汉族，江苏南通人，生于1972年7月，博士，副主任医师。研究方向：胃癌的精准治疗。
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