杨璐1**，王艳霞2，章文2，林希达2，刘江江3，赵浥尘3，胡玉洁2
（1江苏省人民医院手术室，江苏 210029；南通大学2医学院，3杏林学院）
［摘要］目的：探讨泊洛沙姆188与银杏内酯B联合应用对小鼠脑缺血-再灌注损伤的保护作用。方法：以线栓造成小鼠脑组织缺血状态，线栓移除前5min经尾静脉单次注射泊洛沙姆188（0.4g/kg），银杏内酯B（20mg/kg）或两药的混合溶液，24小时后评价小鼠神经症状并测定脑梗死面积和脑含水量。另一批小鼠在静脉注射给药后再每天腹腔注射上述等效剂量药物，24天后统计各组存活状况，绘制生存曲线；采用爬杆试验、悬挂试验测试小鼠肢体运动功能。结果：生理盐水组小鼠脑梗死面积为35.49%±8.31%，P188组、GB组以及合用组的脑梗死面积分别减少为27.76%± 6.41%，25.51%±5.81%和21.16%±8.67%，P188与GB合用组比药物单用组的脑梗死面积更小，差异有统计学意义（P＜0.05）。生理盐水组小鼠24天后的生存率为38.89%，P188组，GB组以及合用组小鼠的生存率分别为50%，53.57%和69.21%。P188与GB合用组与药物单用组相比，生存期明显延长，差异均有统计学意义（P＜0.05）。P188组、GB组以及药物合用组T/turn分别为6.22秒,6.56秒和5.25秒，T/floor分别为15.50秒，14.88秒和13.25秒，P188和GB合用组与药物单用组相比，T/turn和T/floor均显著缩短，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与泊洛沙姆188和银杏内酯B单用相比，联合用药能进一步降低脑梗死面积，延长生存期，增强小鼠肢体的运动功能。结论：泊洛沙姆188与银杏内酯B合用能够增强对小鼠脑缺血-再灌注损伤的保护作用。
［关键词］泊洛沙姆188；银杏内酯B；脑缺血-再灌注；联合用药
脑缺血-再灌注损伤发生的病理生理学机制复杂，主要有自由基、钙离子超载、白细胞以及兴奋性氨基酸的毒性作用等参与。神经保护剂在临床前实验中显示较好的保护作用，但在临床试验阶段大多数药物效果不尽如人意［1］。药物作用靶点局限，是造成神经保护剂研发困境的重要原因，因此联合用药是治疗脑中风的有效方法。银杏内酯B（ginkgolides B，GB）是自银杏叶内提取的萜内酯类单体成分，能够清除自由基，抑制炎症反应［2］，临床资料也表明银杏内酯B具有切实有效的神经保护作用。泊洛沙姆188（P188）是药物制剂中常用的乳化剂和增溶剂，是一种非离子型高分子表面活性剂。研究表明P188还具有广泛的生物学效应［3-4］，如近年来发现P188具有类似创口贴样作用，能修复受损的细胞膜［5］。本研究采用小鼠脑缺血-再灌注损伤模型，比较P188和GB合用与药物单用的疗效，为P188的临床应用转化积累实验资料。
1.1 材料
1.1.1 实验动物：清洁级ICR小鼠，雄性，18～25 g，由南通大学实验动物中心提供［实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2012-0031］。实验在实验动物中心屏障实验室进行。
1.1.2 主要试剂：泊洛沙姆188（Sigma公司，P1300）；银杏内酯B（合肥标品生物科技有限公司）；红四氮唑（中国医药集团上海化学试剂公司，F2006031）；麻醉药Avertin（Sigma公司）。
1.2 方法
1.2.1 小鼠脑缺血再灌注模型制备［6］：采用大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。简述如下：小鼠采用2.5%Avertin腹腔注射麻醉，仰位固定，按顺序分离颈总动脉、颈外动脉。颈外动脉用电凝笔熔断使其游离，再结扎颈总动脉和颈内动脉阻断局部血流，用显微剪在颈外动脉近游离段剪开，将线栓（Doccol Corporation,Redlands,USA，规格：6023）插入至颈总动脉分叉处，再缓慢向颈内动脉方向推入1cm左右，感到阻力时停止。阻断血流2h后，拔出线栓恢复血流（再灌注）。
1.2.2 动物分组：（1）短期实验：50只雄性ICR小鼠随机分为5组，每组10只。假手术组（Sham组）进行手术操作，但不插入线栓阻断血流，生理盐水组（Saline组），P188组（0.4g/kg)，GB组（20mg/kg），以及P188和GB混合溶液组。各组小鼠在拔出线栓恢复血流前经尾静脉注射相应药物或0.9%氯化钠水溶液。线栓移除24h后，对各组小鼠逐个进行神经症状评分，评分后经深度麻醉后取脑，对脑组织行TTC染色，计算脑梗死面积［6］。（2）长期实验：90只雄性ICR小鼠随机分组，其中假手术组（Sham组）10只，生理盐水组（Saline组）、P188（0.4g/kg）组、GB中剂量（20mg/kg），GB和P188混合溶液组各20只。各组小鼠再灌注前预先经尾静脉注射相应的实验药物（药物或生理盐水）后，连续24天每日经腹腔注射等效剂量的相应实验药物，最后统计各组动物的生存率，测试运动功能［6］。
1.2.3 药物配制［7］：GB溶液，先用少量NaOH溶解银杏内酯B，再用盐酸调节pH值至7.4，最后用生理盐水调节。GB与P188混合溶液配制：GB溶解后在pH7.4状态下，用P188和生理盐水溶液定容。
1.2.4 脑梗死面积、神经症状评分及脑含水量测定［6］：缺血再灌注24 h后，将小鼠以颈椎脱臼法处死，取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，剩余脑组织从额极向后做连续冠状切成5片，将脑片置入37℃TTC染料中温浴30min。染色梗死区为白色，正常脑组织为红色。扫描仪扫描脑片，应用图像分析系统测量脑梗死面积并计算脑梗死面积占大脑总面积的百分比。神经症状评分标准：0分：无神经功能缺失症状，活动正常者；1分：不能伸展对侧前爪者；2分：爬行时出现向左转圈者；3分：行走时身体向偏瘫侧倾倒者；4分：不能自发行走，意识丧失者。评分结束后将小鼠深度麻醉再取脑，切除小脑、低位脑干以及嗅球，称取剩余大脑重量为湿重，107℃烘烤72h后称取大脑重量为干重。脑含水量=（湿重－干重）/湿重× 100%。
1.2.5 小鼠运动功能测试［7］：（1）爬杆试验：将木杆（长0.5m，直径1.5cm）垂直放置，将小鼠头朝上放置于木杆的顶端，小鼠头转为向下的时间记为T/turn，小鼠四肢完全到达地面的时间为T/floor。每个小鼠测试5次，间隔5分钟，取平均数进行统计学分析。（2）悬挂试验：将钢丝水平拉直（长60cm，直径1mm），距离地面约1米。在实验前两天，训练小鼠用两个前肢抓住钢丝，第三天正式试验，小鼠抓住钢丝至跌落地面的时间记为T/hang（最长时间为3分钟），每只小鼠测试3次，间隔时间为5分钟，取平均数进行统计分析。
1.3 统计学处理应用GraphPad Prism 5软件对实验数据统计分析、绘制图表。计量数据以均数±标准差表示，组间均数比较进行单因素方差分析结合Dunnett t检验，生存率比较采用log-rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 P188与GB合用对MCAO小鼠脑梗死面积的影响生理盐水组小鼠脑梗死面积为35.49%± 8.31%，P188组、GB组以及合用组的脑梗死面积分别减少为27.76%±6.41%，25.51%±5.81%和21.16%± 8.67%，给药各组保护率分别为21.78%，28.12%和40.38%。与生理盐水组相比，药物单用和合用组的脑梗死面积均显著减小，差异均有统计学意义（P＜0.05）。P188与GB合用组比药物单用组的脑梗死面积更小，差异有统计学意义（P＜0.05），提示P188与GB合用较单药应用效果更佳。如图1。
图1 P188与GB合用对MCAO小鼠脑梗死面积的影响
2.2 P188与GB合用对MCAO小鼠神经症状的影响脑缺血再灌注24 h后，生理盐水组小鼠神经症状评分为2.60±0.84，P188组、GB组和合用组的神经症状评分分别降低为1.80±0.63，1.70±0.67和1.70± 0.82。与生理盐水组相比，药物单用和合用组小鼠在缺血再灌24 h后神经症状显著改善，差异均有统计学意义（P＜0.05），但药物合用组小鼠的神经症状与单药应用组相比并未进一步改善，差异无统计学意义（P＞0.05）。如图2。
图2 P188与GB合用对MCAO小鼠神经症状和脑含水量的影响
2.3 P188与GB合用对MCAO小鼠大脑含水量的影响生理盐水组小鼠大脑含水量为82.85%± 2.33%，显著高于假手术组77.80%±4.55%，差异有统计学意义（P＜0.01）。P188组、GB组以及合用组小鼠大脑含水量分别降低为80.19%±2.35%，79.67%± 2.64%和79.08%±2.81%。与生理盐水组相比，各用药组小鼠脑含水量均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），药物合用组小鼠脑含水量与单药应用组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。
2.4 P188与GB合用对小鼠生存期的影响MCAO小鼠在静脉注射给药后再每天腹腔注射等剂量的药物24天后，绘制各组小鼠的生存曲线。结果显示，生理盐水组小鼠24天后的生存率为38.89%，P188组，GB组以及合用组小鼠的生存率分别为50%，53.57%和69.21%。与生理盐水组相比，各用药组的生存期均显著延长，差异均有统计学意义（P＜0.05）。P188与GB合用组与药物单用组相比，生存期明显延长，差异均有统计学意义（P＜0.05）。如图3。
图3 P188与GB合用对MCAO小鼠生存期的影响
2.5 P188与GB合用对小鼠运动功能的影响实验24天后，爬杆试验中假手术组小鼠在杆子的顶端头转向地面的时间（T/turn）和从杆子顶端爬到地面的时间（T/floor）分别为3.75秒和8.75秒，生理盐水组小鼠所需时间显著增加，为8.86秒和18.75秒，差异均有统计学意义（P＜0.05）。P188组、GB组以及药物合用组T/turn分别为6.22秒,6.56秒和5.25秒，T/ floor分别为15.50秒，14.88秒和13.25秒，与生理盐水组相比均明显缩短，差异均有统计学意义（P＜0.05）。P188和GB合用组与药物单用组相比，T/turn和T/floor均显著缩短，差异均有统计学意义（P＜0.05）。悬挂试验中，假手术组小鼠悬挂于钢丝上的时间（T/hang）为152.9秒，生理盐水组小鼠T/hang显著缩短，为83.50秒，差异有统计学意义（P＜0.05）。P188组、GB组以及药物合用组与生理盐水组相比，T/hang均显著延长，分别为113.3秒，118.9秒和120.9秒，差异均有统计学意义（P＜0.05）。药物合用组与药物单用组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4。
图4 P188与GB合用对MCAO小鼠运动功能的影响
缺血性脑卒中是致病因素多元，发病机制复杂的疾病，单纯针对某一靶点的药物作用有限，因此单靶点药物的组合应用是临床治疗脑缺血的有效方法［8-11］。P188是一类由聚氧乙烯与聚氧丙烯形成的共聚物，在药物制剂中用作乳化剂和增溶剂，P188还具有广泛的生物学效应，我们已证实其对脑缺血的保护作用以及对细胞膜及血脑屏障保护的作用机制［7］。银杏内酯B为银杏叶提取物中的主要活性成分，对血小板活化具有高度特异的拮抗作用，能够清除自由基、抑制血栓和炎症，其对脑缺血性损伤的神经保护作用得到公认［9］。基于两个药物不同的作用靶点，本实验探讨P188与GB联合应用对小鼠脑缺血-再灌注损伤的保护作用，并比较联合应用与药物单用药效方面的差异，为P188的应用研究积累实验资料。
短期的药效研究显示，与P188（0.4g/kg）或GB（20mg/kg）单用相比，尾静脉注射P188和GB混合溶液能进一步降低MCAO小鼠的脑梗死面积，但在脑水肿和神经症状方面与P188或GB单用疗效类似。在长期药效实验中，MCAO小鼠在静脉给予药物后，再连续24天每日经腹腔注射相应等剂量药物，记录各组小鼠存活情况，绘制生存曲线。采用爬杆试验、悬挂试验等方法评价肢体运动功能。研究结果显示：P188和GB合用能显著延长小鼠生存时间，增强小鼠肢体的运动功能，效果优于单用P188或GB。综上所述，P188和GB的合用对脑缺血具有短期和长期的保护作用，其效果优于单用P188或GB。
［参考文献］
［1］Green AR，Odergren T，Ashwood T.Animal models of stroke: do they have value for discovering neuroprotective agents?［J］.Trends Pharmacol Sci，2003，24（8）：402-408.
［2］Maclennan KM，Darlington CL，Smith PE.The CNS effects of Ginkgo biloba extracts and ginkgolide B［J］.Prog Neurobiol，2002，67（3）：235-257.
［3］Marks JD，Pan CY，Bushell T，et al.Amphiphilic,tri-block copolymers provide potent membrane-targeted neuroprotection［J］.FASEB J，2001，15（6）：1107-1109.
［4］Serbest G，Horwitz J.Barbee K The effect of poloxamer-188 on neuronal cell recovery from mechanical injury［J］.J Neurotrauma，2005，22（1）：119-132.
［5］Serbest G，Horwitz J，Jost M.et al.Mechanisms of cell death and neuroprotection by poloxamer 188 after mechanical trauma［J］.FASEB J，2006，20（2）：308-310.
［6］Clark WM，Lessov NS，Dixon MP，et al.Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse［J］. Neurol Res，1997，19（6）：641-648.
［7］Gu JH，Ge JB，Li M，et al.Poloxamer 188 protects neurons against ischemia/reperfusion injury through preserving integrity of cell membranes and blood brain barrier［J］.PLoS One，2013，8（4）：e61641.
［8］Sobrado M，Lopez MG，Carceller F，et al.Combined nimodipine and citicoline reduce infarct size,attenuate apoptosis and increase bcl-2 expression after focal cerebral ischemia［J］. Neuroscience，2003，118（1）：107-113.
［9］Alonso de Leci?ana M，Gutiérrez M,Roda JM,et al.Effect of combined therapy with thrombolysis and citicoline in a rat model of embolic stroke［J］.J Neurol Sci，2006，247（2）：121-129.
［10］Fan X，Ning MM，Lo EH，et al.Early insulin glycemic control combined with tPA thrombolysis reduces acute brain tissue damages in a focal embolic stroke model of diabetic rats［J］.Stroke，2013，44（1）：255-259.
［11］Wang Y，Wang Y，Zhao X.Clopidogrel with aspirin in acute minor stroke or transient ischemic attack［J］.N Engl J Med，2013，369（1）：11-19.
［12］Gu JH，Ge JB，Li M，et al.Inhibition of NF-kappa B activation is associated with anti-inflammatory and antiapoptotic effects of Ginkgolide B in a mouse model of cerebral ischemia/reperfusion injury［J］.European Journal of Pharmaceutical Sciences，2012，47（4）：652-660.
The protective effects of a combination of Poloxamer 188 and Ginkgolide B against the cerebral ischemia-reperfusion injury in mice
YANG Lu1,WANG Yanxia2,ZHANG Wen2,LIN Xida2,LIU Jiangjiang3,ZHAO Yichen3
(1Operating Room,Jiangsu Province Hospital,Jaingsu 210029;2Medical School,Nantong University;3Xinglin School,Nantong University)
［Abstract］Objective:To explore the protective effects of combined Poloxamer 188(P188)and Ginkgolide B(GB)in the mice cerebral ischemia-reperfusion model.Methods:The mouse cerebral ischemia-reperfusion model was established by intraluminal occlusion of middle cerebral artery occlusion(MCAO)using monofilament.P188(0.4g/kg),GB(20 mg/kg) or combination of the two medicines were intravenously injected 5min before reperfusion,24h later mice were sacrificed to determine the infarct size by using of TTC staining,brain water content and neurological symptoms.Another batch of MCAO mice were used to assess the long-term protective effects by intraperitoneal injection of above medicines once a day for 24 days,the survival curve was made,motor function was evaluated with wire hanging test and pole test.Results:Compared with P188 or GB alone,a combination of P188 and GB significantly ameliorated neurological symptoms and reduced the infarct size,the brain edema 24 h after cerebral ischemia/reperfusion injury.Similarly,in the long-term outcome study, a combination of P188 and GB significantly increased survival rate and alleviated motor impairments.Conclusions:The combination of P188 and GB had greater protective effects against the cerebral ischemia/reperfusion injury than that of P188 or Ginkgolide B alone.
［Key words］Poloxamer 188;Ginkgolide B;cerebral ischemia-reperfusion;combination therapy
［文章编号］1006-2440（2016）05-0413-05
［收稿日期］2016-11-15
*［基金项目］中国博士后科学基金项目（2016M601866）；江苏省高校大学生创新创业训练计划项目。
**［作者简介］杨璐，女，汉族，江苏镇江人，生于1988年7月，本科学历。研究方向：神经损伤的基础与临床研究。通信作者：胡玉洁，E-mail：m13861906971@163.com
联系客服
