吴建华1*，姚秀芳1，钱粒2，章建国2
（1如东县人民医院病理科，江苏 226400；2南通大学附属医院病理科）
［摘要］目的：探讨腺苷酸环化酶相关蛋白1（cyclase-associated Protein 1，CAP1）在食管鳞形细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）组织中的表达及临床病理学意义。方法：采用免疫组织化学方法（Envision法）和Western blot方法检测CAP1在98例ESCC石蜡标本和10例新鲜ESCC组织标本中的表达，分析与ESCC临床病理因素的关系。结果：免疫组化结果显示CAP1在98例ESCC组织细胞中阳性表达率为45.9%（45/98），CAP1的表达与淋巴结转移和患者的生存率有相关性（P＜0.05），与患者年龄、性别、组织学分级、肿瘤大小和浸润深度无相关性。Western blot显示伴有淋巴结转移的ESCC中CAP1表达明显高于不伴有淋巴结转移的ESCC。结论：CAP1的高表达可能参与ESCC的侵袭和转移，CAP1高表达可能是预后不良的指标。
［关键词］食管鳞形细胞癌；腺苷酸环化酶1；免疫组织化学
食管鳞形细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是最常见的恶性肿瘤之一，五年生存率10%～20%［1］。近些年，尽管采用了手术治疗和放化疗，其生存率仍然没有得到有效的提高［2］。ESCC的预后率之所以这么低，主要与其淋巴结转移早，并容易局部广泛侵犯周围的组织有关［3］。因此，研究ESCC转移的分子机制至关重要，并为ESCC的治疗提供新的思路。
1.1 一般资料食管鳞形细胞癌98例，来自南通大学附属医院临床病理科2009年1月～12月食管鳞形细胞癌石蜡标本，所有患者术前均未经生物治疗和放化疗。其中男71例，女27例，年龄42～83岁，平均61.8岁。标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，HE常规染色后镜下明确诊断。分别由两名病理医师根据WHO食管癌分类标准（2003）和TNM分期系统（2003），确定肿瘤类型以及临床病理分期。其中包括低分化34例，中分化47例，高分化17例；有淋巴结转移68例，无淋巴结转移30例；肿瘤直径＜5cm者75例，直径≥5cm者23例；TNM分期：Ⅰ期17例，Ⅱ期47例，Ⅲ期34例。对所有患者进行电话随访，随访截止时间为2014年10月，死亡45例，生存53例。另收集10例新鲜食管鳞形细胞癌组织，其中有无淋巴结转移各5例，组织离体后立即放入液氮后置-83℃冰箱保存，以备Western blot检测。
1.2 免疫组化检测标本经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚度连续切片，分别用于HE染色及免疫组化染色。采用Envision二步法检测组织中CAP1的表达。结果判定：CAP1以细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性显色。高倍视野（400×）下选择阳性信号最强的区域计数200个肿瘤细胞中阳性细胞数。按CAP1和E-cadherin表达百分率分为以下4个等级：0%为0分，1%～50%为1分，51%～75%为2分，＞75%为3分。根据免疫组织化学法染色强度分为4个等级：未着色计0分，浅黄色计为1分；棕黄色计为2分；黄褐色颗粒计为3分。阳性判读基于两者相乘得分：0～1分判断为阴性，2～4为低表达，6～9分高表达。
1.3 Western blot分析于4℃下取1～2g标本，加约5倍湿重的裂解缓冲液，粉碎匀浆后，于4℃静置24 h。低温高速离心（4℃12 000 r/min，40分钟），提取上清液（即为总蛋白）。经电泳、转印，5%正常小牛血清封闭，抗CAP1（1∶500），4℃下孵育、过夜。二抗于室温下孵育2h。ECL显色，X线胶片曝光成像，经自动电泳凝胶成像分析仪采集图像。每组结果均为相同条件下重复3次。
1.4 统计学处理采用PASW 18.0统计学软件分析数据，率的比较采用卡方检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2.1 在ESCC组织中CAP1蛋白的表达与患者生存状态的关系免疫组织化学Envision法结果显示，CAP1的表达主要定位于ESCC组织的细胞膜。CAP1在ESCC组织中的阳性表达率为45.9%（45/ 98），在无淋巴结转移的ESCC组织中，CAP1的阳性表达率为26.7%；在有淋巴结转移的ESCC组织中，CAP1的阳性表达率为64.7%。98例食管鳞形细胞癌患者的生存状态与临床病理因素分析显示，患者生存状态与淋巴结是否转移具有相关性，而与患者年龄、性别、肿瘤大小和浸润深度无相关性（见表1，图1、2）；同时显示患者的生存状态与CAP1蛋白的表达具有相关性，即在死亡组CAP1表达升高，而在生存组明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
表1 在98例食管鳞形细胞癌病例中患者的生存状态与临床病理因素间的关系
*P＜0.05
图1 CAP1在ESCC中呈强阳性表达（Envision法，200×）
图2 CAP1在ESCC中呈弱阳性表达（Envision法，200×）
2.2 Western blot检测ESCC组织中CAP1蛋白的表达结果显示，CAP1蛋白在有淋巴结转移的ESCC中的表达，明显高于无淋巴结转移的癌组织，差异具有统计学意义（P＜0.01），见图3。
图3 Western blot检测显示CAP1蛋白在ESC中有淋巴结转移组的表达
2.3 生存率分析在98例食管癌中，CAP1高表达的患者中生存率为30.4%，CAP1低表达的患者中生存率为75.0%。在单变量分析中，Kaplan-Meier生存曲线显示，ESCC患者CAP1表达越高，其生存时间越短，CAP1高表达导致患者的生存率降低。多因素Cox比例风险模型显示CAP1蛋白的表达为独立的预后因子。
图4 Kaplan-Meier生存曲线
表298 例ESCC患者COX回归统计多因数生存分析
*P＜0.05
肿瘤细胞生物学和分子生物学的研究表明，ESCC的发生是一个多步骤、多因素协同参与和作用的过程［5］，在分子水平上对ESCC的发生发展进行研究，将有助于ESCC治疗的探索和预后的判断。腺苷酸环化酶相关蛋白（CAP）是一种具有多种功能的蛋白质，在人体和小鼠中存在两种亚型（CAP1和CAP2）。其中CAP1参与细胞肌动蛋白的调控和细胞的运动，肌动蛋白是细胞的骨架，肌动蛋白的单体通过聚合和解聚，完成细胞运动。在这个过程中腺苷酸环化酶1（CAP1）起了重要的桥梁作用，有研究表明细胞骨架参与了细胞的运动，导致肿瘤的上皮间质转化和转移［6］。在网柄菌属的吞噬过程中，CAP蛋白质之间通过腺苷酸环化酶发挥相互作用，从而直接影响信号通路的转录，并且可以作为细胞骨架的重要调节因子。在酵母中，在Ras信号通路的调控下，CAP参与调节腺苷酸环化酶的活性［7-9］，但是CAP蛋白在哺乳动物中的作用尚不明确。CAP1在Ras信号通路中的作用还有待进一步的研究。Yamazaki等［10］研究了CAP1表达与胰腺癌的关系，结果提示，胰腺癌的组织中CAP1蛋白的表达水平明显高于对应的癌旁组织，而且，CAP1蛋白过表达的患者，更容易发生淋巴结的转移和神经系统的侵袭。当CAP1的表达水平被敲低之后，胰腺癌细胞的侵袭性和迁徙性均下降。有研究发现非小细胞性肺癌中CAP1的高表达与脑转移存在相关性，并预示着更差的预后［11］。
食管鳞形细胞癌作为上皮来源的恶性肿瘤，上皮间叶转化在食管鳞形细胞癌的发生发展中起了重要的作用。上皮间叶分化（epithelial-mesenchymal transiton，EMT）是胚胎发育过程中的一个基本生理现象，参与组织分化和器官的塑性。在肿瘤组织中，其主要特点是上皮细胞失去极性和细胞间的连接，细胞骨架重排，运动能力增强，促进了肿瘤浸润和转移。Niwa等［6］对78例ESCC研究发现，EMT高表达组ESCC患者的预后明显差于低表达组，并具有独立的预后价值。以往研究表明CAP1是一种细胞肌动蛋白调整因子，参与了细胞的运动和肿瘤侵袭和转移，其是否参与和调控EMT仍值得研究。
本文采用免疫组织化学检测了CAP1在98例ESCC组织中的表达，并分析其与临床病理参数之间的关系，结果发现CAP1在食管鳞形细胞癌中的表达明显高于癌旁的正常组织，CAP1的表达与癌组织的淋巴结转移密切相关，而与肿瘤的大小、组织学分级和TNM分期等临床病理因素无相关性，结果表明CAP1在ESCC中参与了癌组织发生和转移的相关机制。本文对98例ESCC进行了随访，采用了kaplan-merier生存分析分析CAP1的表达与患者的生存的关系，发现CAP1表达越高，患者的预后越差，而COX多因素回归分析结果显示CAP1是独立的预后因子，结果表明CAP1可以作为ESCC预后判断的指标之一。
综上所述，CAP1蛋白在食管鳞形细胞癌癌变过程中发挥重要作用，将其作为靶点，可为食管鳞形细胞癌的治疗和预后判断提供一个新思路。本文基于蛋白水平对CAP1在食管鳞形细胞癌组织中表达与临床病理因素之间的关系进行了初步探索，还不能完全阐述CAP1是如何促进ESCC的发生和发展的机制，以及在此过程中涉及到哪些分子哪些信号通路等，还有待于在细胞学水平和裸鼠模型中进一步研究和证实。
［参考文献］
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Expression and Significance of Cyclase-associated Protein 1(CAP1) in Esophageal Squamous Cell Carcinoma
WU Jianhua1,YAO Xiufang1,QIAN Li2,ZHANG Jianguo2
(1Department of Pathology,People’s Hospital of Rudong,Jiangsu 226400;
2Department of Pathology,Affliated Hospital of Nantong University)
［Abstract］Objective:To investigate the clinicopathological significance of expression of Cyclase-associated Protein 1(CAP1)in esophageal cell carcinoma(ESCC).Methods:The CAP1 protein was detected by immunohistochemistry in 98 cases of ESCC,and by western blot assay in 10 cases of ESCC respectively.Results:The CAP1 positive rate was 45.9%（45/ 98）in 98 cases of ESCC,and negatively associated with E-cadherin,and positively associated with lymph node metastase and poor survival.There were no relationships between CAP1 and age,gender,pathologic grading,tumor size and depth. Western blot assay show that CAP1 levels in ESCC tissues without lymph node metastases were significantly lower than those with lymph node metastases,and E-cadherin levels were on the contrary.Conclusions:CAP1 may be involved in the metastasis of esophageal squamous cell carcinoma,and the elevated levels of CAP 1 expression may indicate a poor prognosis.
［Key words］esophageal squamous cell carcinoma;cyclase-associated Protein 1;immunohistochemistry
［中图分类号］R735.1
［文献标志码］A
［文章编号］1006-2440（2016）05-0430-04
［收稿日期］2016-09-08
*［作者简介］吴建华，女，汉族，江苏如东人，生于1979年4月，本科，主治医师。研究方向：肿瘤病理。通信作者：姚秀芳，E-mail:hssmy173@sina.com
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