卞兆连1**，陈 琳1，居林玲1，苗 琪2，马 雄2，邵建国1，管海涛1
（1南通市第三人民医院，南通市肝病研究所，江苏226006；2上海交通大学医学院附属仁济医院消化内科，上海市消化疾病研究所）
［摘 要］目的：研究原发性胆汁性胆管炎（primary biliary cholangitis，PBC）中发生CD8+细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）穿入现象及其意义。方法：收集53例PBC患者肝穿刺标本，采用H&E染色和免疫荧光染色方法，在光学显微镜和激光共聚焦显微镜下观察PBC肝组织中CTL的穿入及穿入宿主细胞的类型，并分析与病程的关系。结果：53例PBC患者中10例（18.9%）发生淋巴细胞穿入肝细胞，15例（28.3%）发生淋巴细胞穿入胆管上皮，仅1例患者同时存在淋巴细胞穿入肝细胞和胆管上皮细胞。免疫荧光染色证实穿入的淋巴细胞是CD8阳性细胞毒性T细胞（CTL）。早期PBC患者中4例（22.2%）、晚期PBC患者中6例（17.1%）发生CTL穿入肝细胞，两组差异无统计学意义（P＞0.05）。早期PBC患者中9例（50.0%）、晚期PBC患者中6例（17.1%）发生CTL穿入胆管上皮，两组差异有统计学意义（Z=2.52，P＜0.05）。结论：在PBC肝组织中，CTL可穿入肝细胞和胆管上皮细胞，CTL穿入胆管上皮细胞并导致其发生凋亡可能是PBC发病过程中胆管损伤的机制之一。
［关键词］穿入现象；原发性胆汁性胆管炎；胆管上皮
原发性胆汁性胆管炎（primary biliarycholangitis，PBC）是一种以肝内小叶间胆管非化脓性炎症破坏为主要病理特征的自身免疫性肝病［1］。PBC常见于中老年女性，临床主要表现为胆汁淤积性肝病，95%患者血清抗线粒体抗体（anti-mitochondria antibody， AMA）阳性，随着病程进展可发展为肝硬化、肝癌等终末期肝病，严重影响患者生活质量及寿命［1］。随着自身抗体检测和肝活检等技术的广泛开展，我国临床医师对PBC认识的不断提高，该病的检出率明显上升，已经成为我国非病毒性肝病的重要组成部分［2］。迄今为止，PBC发病机制仍未阐明，普遍认为是环境因素作用于遗传易感性个体，导致胆管上皮免疫性损伤。穿入（emperipolesis）现象由Humble等［3］在1956年首次提出，是指一个活细胞进入另一个活细胞的现象，穿入可发生于肿瘤细胞之间、免疫细胞与肿瘤之间或者免疫细胞和正常细胞之间［4］。1978年，Sandilands等［5］研究发现淋巴细胞可穿入人肝细胞，后续的研究陆续发现穿入现象可见于自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）、药物性肝炎、病毒性肝炎等多种肝脏疾病［6-8］。本文收集2008～2015年在南通市第三人民医院及上海交通大学医学院附属仁济医院行肝穿刺组织病理学确诊的PBC 53例患者临床资料，着重研究PBC患者肝组织中穿入现象，并探讨其临床意义。
1.1 一般资料 PBC 53例患者中男性4例，女性49例，男∶女为1∶8.16，年龄29～85岁，平均52.2岁。PBC诊断参照巴黎标准［9］：（1）血清AMA阳性，尤其是M2阳性；（2）血清胆汁淤积酶升高（谷氨酰胺转肽酶及碱性磷酸酶）；（3）肝脏组织病理提示非化脓性破坏性胆管周围炎；以上标准至少符合2条或2条以上。53例PBC患者中根据Scheuer stage评分系统，分为早期（Scheuer stageⅠ/Ⅱ）18例（34.0%），晚期（Scheuer stageⅢ/Ⅳ）35例（66.0%）。
1.2 苏木素-伊红染色法（H&E） 常规10%福尔马林溶液固定肝穿刺标本，浸蜡、包埋，连续切片4μm厚；二甲苯、酒精等程序脱蜡水化，随后予以苏木素及伊红染液浸染，酒精梯度上行、二甲苯透明后，中性树胶封片，由病理医师在显微镜下观察并统计。
1.3 免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜下观察 肝穿刺石蜡切片常规脱蜡水化后，PBS洗5min×2次；随后予以3%H2O2室温孵育15min，PBS洗涤5min× 3次，立即予以pH6.0柠檬酸盐抗原修复液（微波修复10min），冷却至室温；PBS冲洗3次，5min/次；滴加50μL封闭血清，室温下封闭30min；去除封闭液，滴加一抗（抗-CK8/18抗体、抗-CK7抗体和抗-CD8抗体，抗体工作浓度均为1：100；抗体及一抗稀释液均购于DAKO公司），置于湿盒中4℃冰箱过夜。次日PBS冲洗5min×3次，分别滴加相应的荧光二抗（由DYLight594分别标记抗-CK8/18抗体和抗-CK7抗体呈红色，由FITC标记抗-CD8抗体呈绿色，由DAPI标记核呈蓝色，1：3000稀释，Invitrogen公司）室温孵育30min；PBS冲洗5min×3次，晾干后，滴加DAPI-Fluoromount-GTM封片，在激光共聚焦显微镜（Carl Zeiss）下观察并摄片。
1.4 统计学处理 应用Graphpad prism 6统计软件分析数据，率的组间差异性比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 PBC患者中淋巴细胞穿入的类型 通过观察H&E染色的组织切片发现细胞穿入可发生于淋巴细胞与肝细胞或与胆管上皮细胞之间。淋巴细胞穿入的肝细胞表现为胞浆疏松、肿胀，未出现嗜伊红染色，提示宿主肝细胞处于肿胀变性（图1A）。淋巴细胞穿入胆管上皮显示为淋巴细胞与胆管上皮细胞密切接触、部分穿入或完全穿入胆管上皮内；同时胆管上皮细胞胞浆发生嗜伊红染色，细胞固缩，提示胆管上皮细胞发生早期凋亡（图1B、1C、1D）。
图1 PBC患者肝内穿入现象（400×）
A：淋巴细胞穿入肝细胞；B：淋巴细胞和胆管上皮细胞接触；C和D：淋巴细胞穿入胆管上皮细胞内。
53例PBC患者中10例（18.9%）发生淋巴细胞穿入肝细胞，15例（28.3%）发生淋巴细胞穿入胆管上皮，提示在PBC中淋巴细胞穿入胆管上皮更为常见。仅1例患者同时存在淋巴细胞穿入肝细胞和胆管上皮细胞。免疫荧光染色激光共聚焦显微镜下证实PBC病变组织中穿入的淋巴细胞是CD8阳性T淋巴细胞，即为细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），图2A，图2B。
图2 激光共聚焦显微镜下显示CTL穿入肝细胞（A）和胆管上皮（B）（600×）
A：CK8/18标记的肝细胞（红色）和CD8标记的CTL（绿色），DAPI标记核呈蓝色；B：CK7标记的胆管上皮（红色）和CD8标记的CTL（绿色），DAPI标记核呈蓝色。
2.2 不同病程CTL穿入发生率的比较 CTL穿入肝细胞的发生率，早期PBC患者中4例（22.2%），晚期PBC患者中6例（17.1%），两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。CTL穿入胆管上皮的发生率，早期PBC患者中9例（50.0%），晚期PBC患者中6例（17.1%），两组间差异有统计学意义（Z=2.52，P＜0.05）。
已知PBC的发病与环境因素以及遗传易感性密切相关，遗传易感性个体在环境因素的作用下，出现针对自身抗原的免疫细胞，引起肝内小胆管的免疫性损伤［10］。有研究显示，肝内小叶间胆管是PBC累及的主要部位，胆管上皮细胞凋亡是PBC重要的病理特征之一，具体何种机制导致胆管上皮细胞凋亡仍未完全阐明［11］。
研究认为PBC发病基础是机体免疫耐受被打破，自身反应性T细胞在肝脏局部聚集，造成器官特异性的自身免疫性肝病。在PBC中，异常的免疫细胞主要包括效应T细胞、B细胞等，主要攻击胆管上皮细胞，导致胆管上皮细胞损害，最终发生以小胆管损伤为主要特征的非化脓性胆管周围炎［12］。研究显示，PBC发病机制中的免疫紊乱主要涉及肝内Th1、Th2、Th17免疫平衡紊乱，导致自身反应的异常淋巴细胞在肝内聚集；另外，调节性T细胞、巨噬细胞同样在PBC的发生发展中发挥重要作用，主要通过抑制效应T细胞功能及分泌炎症因子等途径，参与疾病的发病过程［13］。美国学者发现小鼠肝细胞可通过穿入机制清除自身反应性CD8阳性T细胞；而自身反应性CD8阳性T细胞回输给小鼠后，在肝内迅速被清除，不会引起肝内炎症，主要是通过淋巴细胞穿入肝细胞这一机制来实现［14］。
1956年，Humble等［3］研究发现淋巴细胞可以进入其他体外培养的细胞，并提出了细胞穿入的概念。随后的研究发现，淋巴细胞可穿入多种细胞，主要包括成纤维细胞、巨核细胞和乳腺癌细胞［15-17］。Sandilands等［5］发现体外培养的张氏肝细胞可被淋巴细胞穿入。近年来发现多种淋巴细胞，如人T淋巴瘤细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞等均可穿入肝细胞［18］。AIH、病毒性肝炎和药物性肝损伤患者肝组织中均存在穿入现象，尤其在AIH中特别明显，是AIH的特征性病理表现［6-8］。Miao等［19］研究发现，在AIH中穿入现象主要发生在淋巴细胞与肝细胞之间。本文结果显示，在PBC患者中同样存在穿入现象，而且穿入现象不仅发生在淋巴细胞与肝细胞之间，也发生在淋巴细胞与胆管上皮之间，免疫荧光染色证实穿入的淋巴细胞是CD8阳性的细胞毒性T细胞（CTL）。说明穿入的CTL可通过细胞毒作用发挥杀伤胆管上皮的作用，促进胆管上皮细胞凋亡，导致胆管损伤，这可能是PBC发病过程中胆管上皮细胞损害的机制之一。进一步研究显示，CTL穿入肝细胞现象与PBC病程无明显相关性，而CTL穿入胆管上皮与病程明显相关，随着疾病病程进展，CTL穿入胆管上皮现象明显减少。这可能与疾病后期肝纤维化明显加重，胆管炎反而减轻，以及在疾病后期常常合并胆管消失等有关。本研究提示在PBC的发生发展中，CTL穿入胆管上皮细胞可能更为重要。
综上所述，PBC中既存在CTL穿入肝细胞，也存在CTL穿入胆管上皮，其中以CTL穿入胆管上皮为主，可诱导胆管上皮细胞凋亡，参与PBC发病过程中的胆管损害，并与疾病病程明显相关。
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Explore the features and significance of cytotoxic T lymphocytes emperipolesis in primary biliary cholangitis
BIAN Zhaolian1，CHEN Lin1，JU Linlin1，MIAO Qi2，MA Xiong2，SHAO Jianguo1，GUAN Haitao1
（1Nantong Third People's Hospital，Nantong Institute of Liver Disease，Jiangsu 226006；2Division of Gastroenterology and Hepatology，Renji Hospital，School of Medicine，Shanghai Jiaotong University，Shanghai Institute of Digestive Disease）
［Abstract］Objective：To explore the features of CD8 positive cytotoxic T lymphocytes（CTL）emperipolesis and its correlation with course of disease in primary biliary cholangitis（PBC）.Methods：H&E staining was used to determine the phenotype of emperipolesis in PBC.In immunofluorescence，CK8/18 was the marker of hepatocytes，while CK7 was used to mark cholangiocyte，and CD8 was the marker of CTL；Phenotypes of emperipolesis were observed under optical and laser confocal microscopes；And analyzed the correlation between emperipolesis and disease progression.Results：Two kinds of emperipolesis were observed in PBC，one is‘CTL into hepatocyte'，another is‘CTL into cholangiocyte'.Negative correlation between‘CTL into cholangiocyte'and course of disease was found.‘CTL entry into cholangiocyte'lead to apoptosis of cholangiocyte.Conclusion：Both‘CTL into hepatocyte'and‘CTL into cholangiocyte'were observed in PBC，and apoptosis of cholangiocyte induced by‘CTL into cholangiocyte'may be a mechanism of bile duct damage in PBC.
［Key words］emperipolesis；primary biliary cholangitis；cholangiocyte
［中图分类号］R575.7
［文献标志码］A
［文章编号］1006-2440（2016）04-0307-04
*［基金项目］南通市科技局资助项目（MS22015105，HS2014061，BK2014073）；江苏省科技厅资助项目（BK2016420）。
**［作者简介］卞兆连，男，江苏盐城人，生于1984年2月，博士，主治医师。研究方向：慢性肝病免疫学发病机制。 通信作者：管海涛，E-mail：nantonghaitao@163.com
［收稿日期］2016-07-14
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