刘娟娟1，薛知信1，王保学2，李亚楠2，粟 艳2，周泽奇2
[1.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2. 丹娜（天津）生物科技有限公司，天津 300467]
摘要：目的优化鲎试剂动态显色法检测血清样本中脂多糖的处理工艺，降低脂多糖检测中的干扰因素。方法在单因素试验基础上，采用三因素三水平的响应面分析法研究表面活性剂用量﹑碱用量﹑处理时间及其交互作用对样本中脂多糖检测结果的影响。结果最佳样本处理工艺为：0.6% Triton X-100与0.020 mol/L KOH等体积混匀作为样本处理液，处理时间10 min。在该工艺下，干扰因素最少，临床符合率可达83.25%。结论建立的最佳样本处理工艺对临床特殊样本（黄疸﹑溶血﹑乳糜）的抗干扰能力强，优化后的脂多糖测定方法可显著提高临床样本检测的准确率。
关键词：脂多糖；鲎试剂；干扰因素
革兰阴性菌感染有逐年增加的趋势，临床上常用培养的方法对该类菌进行检测，但其耗时较长[1]。用鲎试剂来检测该类菌细胞壁的组成成分——脂多糖，能对内毒素血症﹑革兰阴性菌血流感染和革兰阴性菌感染患者进行早期诊断[2-3]。虽然用鲎试剂检测脂多糖比较方便﹑快捷，但该方法易受多种因素影响[4]，主要包括以下3种：（1）不适宜的pH值。鲎试剂反应的最佳pH值为6.8～7.4[5]。（2）蛋白或酶修饰。血液中的一些蛋白能够中和内毒素，并且血液中包含对鲎试验产生影响的丝氨酸蛋白酶，此外血液中的一些酶会降解或激活鲎试剂级联反应中的某些蛋白，导致检测错误[6]。（3）非特异性鲎试剂反应。已知1，3-β-G葡聚糖可以与鲎试剂反应并形成凝胶[7]。以上因素往往导致假阳性或假阴性结果的产生，从而影响最终的临床诊断效果。本研究主要通过单因素试验及响应面分析法对鲎试剂检测中的样本处理工艺进行优化，开发出适合检测人血清样本的处理工艺，以最大限度地降低脂多糖检测中的干扰因素，为临床诊断提供参考依据。
1.1 材料
1.1.1 样本 收集天津市海河医院临床就诊的革兰阴性菌感染的菌血症患者血清样本89例（其中溶血﹑黄疸及乳糜样本各3例），患者男40例﹑女49例，年龄（40±15）岁。临床确诊革兰阴性菌感染的依据为：患者在临床上出现感染的症状和体征，如发热﹑呕吐﹑腹泻等；对患者的痰﹑尿﹑血﹑大便﹑创口分泌物及腹水样本连续进行2次细菌培养，均有革兰阴性菌生长。对照组：采集来自丹娜（天津）生物科技有限公司的89名正常人血清样本（其中溶血样本3例），受试者男49名﹑女40名，年龄（39±16）岁。各组间性别﹑年龄等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
1.1.2 试剂 内毒素标准品﹑内毒素质控品﹑反应主剂﹑溶解液及主剂复溶液由丹娜（天津）生物科技有限公司提供，KOH﹑Nonidet P-40（NP-40）及Triton X-100均购自Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 血清的制备 用一次性无菌无热原真空采血管采取研究对象静脉血4 mL，以1 200×g离心10～15 min，收集血清，在2 h内检测（若无法及时检测，全血可在4 ℃保存1 d）。
1.2.2 标准品溶液制备及质控品复溶 向革兰阴性菌脂多糖标准品中加入1.5 mL溶解液配制成0.16 EU/mL溶液，涡旋震荡至少10 min，倍比稀释至0.08﹑0.04﹑0.02﹑0.01 EU/mL溶液，分别记为a﹑b﹑c﹑d﹑e，倍比稀释振荡时间各1 min。将1.5 mL溶解液加入到质控品试剂瓶中，涡旋震荡至少10 min。向微孔板阴性对照孔中加入60 μL溶解液，微孔板标准品孔中分别加入60 μL标准品a～e溶液。
1.2.3 血清样本的处理 配制不同配方的处理液，向微孔板样本孔中加入20 μL样本/或质控品和40 μL处理液，孔板震动5～10 s混匀，37 ℃处理不同时间。
1.2.4 加反应主剂 用1.3 mL主剂复溶液和1.3 mL溶解液溶解反应主剂，振荡混匀，静置待用。向标准品和样本/或质控品孔中各加入100 μL反应主剂，孔板震动5～10 s。37 ℃﹑405 nm（492 nm为参比波长）波长下连续检测40 min，反应结束后得出吸光度（A）值变化的平均速率（ΔmA/min）。
1.2.5 结果计算 反应结束后，以内毒素浓度为横坐标，平均速率为纵坐标，进行二次拟合，绘制标准曲线，根据标准曲线计算样本/或质控品中革兰阴性菌脂多糖的含量。
1.2.6 结果解释 对89名对照者样本及89例确诊革兰阴性菌感染者样本进行检测，绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线（图1），计算约登指数，以此来确定阈值。阈值在0.08 EU/mL以下为阴性，说明无革兰阴性菌感染；0.08～0.11 EU/mL为灰区，应连续检测；在0.11 EU/mL以上为阳性，怀疑为革兰阴性菌感染，建议结合临床症状进行治疗。
图1 脂多糖诊断革兰阴性菌感染的ROC曲线
1.2.7 临床符合率计算 把灰区样本视为阴性，以临床确诊结果为标准，计算不同样本处理程序检测结果的临床符合率。
1.3 统计学方法
通过单因素试验结果分析，选择KOH水平﹑Triton X-100水平﹑样本处理时间三因素，以临床符合率作为判定标准，应用Design-Expert Software 8.0.6.1软件进行三因素三水平的响应面分析，根据响应面分析法结果确定最佳的样本处理方法。
2.1 单因素试验
2.1.1 表面活性剂的种类及含量对检测结果的影响 分别选取0.3%Triton X-100﹑0.6%Triton X-100﹑0.9%Triton X-100﹑1.2%Triton X-100及0.3% NP-40﹑0.6% NP-40﹑0.9% NP-40﹑1.2% NP-40与0.020 mol/L KOH等体积混匀作为样本处理液，37 ℃处理10 min，按照上文所述方法对89名对照者及89例确诊革兰阴性菌感染者的样本进行检测，计算临床符合率，见图2。Triton X-100对血清样本的处理效果比NP-40好；0.6% Triton X-100与0.020 mol/L KOH等体积混匀后处理10 min对样本的处理效果最好。
2.1.2 KOH水平对检测结果的影响 选取0.010﹑0.020﹑0.030﹑0.040 mol/L KOH与0.6% Triton X-100等体积混匀作为样本处理液，37 ℃处理10 min，按照上文所述方法对89名对照者及89例确诊革兰阴性菌感染者的样本进行检测，计算临床符合率，见图3。在所选的处理液体系中，0.020 mol/L KOH与0.6% Triton X-100等体积混匀后处理10 min对样本的处理效果最好。
图2 表面活性剂种类及含量对临床符合率的影响
注：
图3 KOH水平对临床符合率的影响
2.1.3 样本处理时间对检测结果的影响 采用0.020 mol/L KOH与0.6% Triton X-100等体积混匀作为处理液，处理时间分别为5﹑10﹑15和20 min，按照上文所述方法对89名对照者及89例确诊革兰阴性菌感染者的样本进行检测，计算临床符合率，见图4。当样本处理时间＜10 min时，临床符合率随样本处理时间的延长迅速提高；当处理时间为10 min时，临床符合率高达79%；＞10 min时，临床符合率变化趋于平缓，基本保持在82%左右，说明10 min可作为临床可选择的最佳处理时间。
2.2 响应面分析法对样本处理方法进行优化
2.2.1 响应面因素及水平的选取 根据Box-Behnken试验设计原理，综合单因素试验分析结果，采用三因素三水平的响应面分析法对反应条件进一步优化，试验因素及水平见表1。
图4 样本处理时间对临床符合率的影响
表1 响应面因素和水平
因素 水平-1 0 1 X1[Triton X-100水平（%）] 0.3 0.6 0.9 X2[KOH水平（mol/L）] 0.01 0.02 0.03 X3[反应时间（min）] 5 10 15
2.2.2 响应面分析法的方案及结果 以X1﹑X2﹑X3为自变量，临床符合率Y为响应值，响应面分析法的方案及结果见表2。
表2 响应面分析法的方案及结果
试验编号 X1 X2 X3 Y（%）1 -1 -1 0 30.899 2 1 -1 0 48.315 3 -1 1 0 72.472 4 1 1 0 45.506 5 -1 0 -1 37.640 6 1 0 -1 51.124 7 -1 0 1 65.169 8 1 0 1 70.225 9 0 -1 -1 28.652 10 0 1 -1 54.494 11 0 -1 1 43.258 12 0 1 1 68.539 13 0 0 0 78.652 14 0 0 0 79.775 15 0 0 0 80.337 16 0 0 0 82.022 17 0 0 0 83.146
通过Design-Expert Software 8.0.6.1软件对表2结果进行回归分析，得到优化后的响应值动态参数方程：Y=-192.696 63+252.996 25X1+ 1 129.213 48X2+12.904 49X3-3 698.501 78X1X2-1.040 449X1X3-2.808 99X2X3-134.363 3X12-193 961X22-0.506 18X32。
对上述回归模型进行方差分析，结果见表3，该模型具有统计学意义（P＜0.01），决定系数（R2）=0.969 5，说明可用此模型进行临床符合率的预测及评估。
表3 回归方程的方差分析结果
注：R2=0.969 5，R2Adj=0.930 2
变异来源自由度 平方和 均方 F值 P值＞F值X1 1 10.1 10.1 0.41 0.540 7 X2 1 1 009.97 1 009.97 41.34 0.000 4 X3 1 708.4 708.4 29 0.001 0 X1X2 1 492.44 492.44 20.16 0.002 8 X1X3 1 17.75 17.75 0.73 0.422 1 X2X3 1 0.079 0.079 0.003 0.956 3 X1X1 1 615.72 615.72 25.2 0.001 5 X2X2 1 1 584.03 1 584.03 64.84 ＜ 0.000 1 X3X3 1 674.26 674.26 27.6 0.001 2模型 9 5 427.56 603.06 24.69 0.000 2误差 7 171 24.43总误差 16 5 598.56
用响应面分析法对最优临床符合率进行预测，得到最佳处理工艺为：0.6% Triton X-100 与0.020 mol/L KOH等体积混匀作处理液，处理时间为11.91 min，此时临床符合率最高，为84.34%。考虑到实际操作的方便，确定处理时间为10 min。以此工艺处理样本，进行3次平行试验，得到临床符合率的均值为83.25%，与理论优化结果基本相符。
本研究结果显示，选用0.6% Triton X-100与0.020 mol/L KOH等体积混匀作为样本处理液，处理10 min对样本的处理效果最好。这可能是因为该水平的Triton X-100能破坏血清中某些蛋白与内毒素的结合，且能分散内毒素，使血清中的内毒素更容易被鲎试剂检测到。该水平的KOH可抑制血清中丝氨酸蛋白酶活性，但又不影响鲎试剂中参与级联反应的酶活性。
本研究还显示，样本处理时间＞10 min，处理效果基本不变。说明处理10 min时，处理液对样本的处理程度已达到最高，继续延长时间，处理效果基本不再变化。
响应面分析法结果表明，KOH对样本处理效果的影响较大（P=0.000 4），Triton X-100与KOH交互作用也对样本处理效果有明显影响（P=0.002 8）。这可能是由于血液中的蛋白或蛋白碎片可以结合脂多糖，而以这种结合形式存在的脂多糖不能被鲎试剂检测到，但一定比例的表面活性剂及碱可以破坏它们之间的结合[8]，使脂多糖尽可能多地以游离形式存在，以保证检测结果更符合临床实际；同时碱能够抑制血清中丝氨酸蛋白酶的活性，减少其对鲎试剂的影响。因此可把0.6% Triton X-100 与0.020 mol/L KOH等体积混匀作为样本处理液，处理时间为10 min，作为鲎试剂检测中血清样本的处理工艺。
综上所述，采用0.6% Triton X-100与0.020 mol/L KOH等体积混匀作为处理液，处理时间为10 min，干扰因素最少，可显著提高临床样本检测的准确率，临床符合率达到83.25%。
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Minimizing interference in the detection of lipopolysaccharide in serum
LIU Juanjuan1，XUE Zhixin1，WANG Baoxue2，LI Yanan2，SU Yan2，ZHOU Zeqi2.
[1. College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2. Dynamiker Biotechnology （Tianjin） Co.，Ltd.，Tianjin 300467，China]
Abstract：ObjectiveTo optimize treatment process of chromogenic kinetic limulus amebocyte lysate assay for lipopolysaccharide in serum and reduce interference factors.MethodsOn the basis of single factor experiments，response surface methodology with 3 factors and 3 levels was used to study the effects and interactions of surfactant，alkali dosage and treatment time.ResultsThe treatment process was optimized as follows：0.6% Triton X-100 mixed with equal volume of 0.020 mol/L KOH as treatment reagent，treatment time 10 min. Under these conditions，the clinical coincidence rate was 83.25%.ConclusionsThis treatment process can be used to detect special samples，including jaundice，hemolysis and chyle，and can provide a reference for clinical diagnosis.
Key words：Lipopolysaccharide；Limulus amebocyte lysate；Interference factors
文章编号：1673-8640（2017）02-0131-04
中图分类号：：R446.5
文献标志码：：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2017.02.014
（收稿日期：2016-01-27）
（本文编辑：姜 敏）
作者简介：刘娟娟，女，1989年生，硕士，主要从事临床微生物疾病早期诊断研究。
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