吴 蓉1， 吕玉江2， 戴俊华1， 相芬芬1， 孔倩倩1， 钱 宁1， 张贵留2， 杨玉玲2， 陈丽春2， 康向东1
（1.上海中医药大学附属普陀医院检验科，上海 200062；2.玉溪市江川区人民医院检验科，云南 玉溪 652600）
摘要：目的 研究云南玉溪市江川地区产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）大肠埃希菌对氨基糖苷类抗菌药物的耐药性及其耐药基因表达的频率，并对其耐药基因进行测序分析。方法 采用纸片扩散法检测32株产ESBLs大肠埃希菌对庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素和奈替米星的耐药性。采用聚合酶链反应（PCR）检测7种氨基糖苷类修饰酶（AME）基因[aac（3）-Ⅰ、aac（3）-Ⅱ、aac（6′）-Ⅰad、aac（6′）-Ⅰb、aac（6′）-Ⅱ、ant（3″）-Ⅰ、ant（2″）-Ⅰ]和6种16S rRNA甲基化酶基因（armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA），采用双脱氧末端终止法对aac（3）-Ⅱ基因进行测序分析。结果 32株产ESBLs大肠埃希菌对庆大霉素、阿米卡星、奈替米星、卡那霉素和妥布霉素的耐药率分别为100%、0%、0%、18%和87%。有6株菌株同时携带2种AME基因。从32株产ESBLs大肠埃希菌中检出aac（3）-Ⅱ、aac（6′）-Ⅰb、ant（3″）-Ⅰ、ant（2″）-Ⅰ4种AME基因，阳性率分别为100%、9.4%、6.2%和3.1%；未检出16S rRNA甲基化酶基因。32株产ESBLs大肠埃希菌中有4株发生相同的aac（3）-Ⅱ突变，分别为G232A、 T251C、 G580A和 T612A。8株不产ESBLs大肠埃希菌均未检出AME基因及16S rRNA甲基化酶基因。结论 云南玉溪市江川地区产ESBLs大肠埃希菌耐氨基糖苷类药物与AME基因表达有关，奈替米星的耐药率增加可能与aac（3）-Ⅱ基因突变有关。
关键词：大肠埃希菌；氨基糖苷类修饰酶基因；16S rRNA甲基化酶基因
大肠埃希菌是临床分离的革兰阴性杆菌中最常见的条件致病菌。超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum beta-lactamases，ESBLs）是能水解青霉素类、头孢菌素类以及单环类抗菌药物的一类酶[1]。氨基糖苷类抗菌药物是一种治疗革兰阴性杆菌（如大肠埃希菌）感染的重要抗菌药物。氨基糖苷类药物耐药主要是由氨基糖苷类修饰酶（aminoglycoside-modifying enzyme，AME）和16S rRNA甲基化酶引起的。各种AME基因及16S rRNA甲基化酶基因可移动遗传元件介导耐药[2-4]，故易于在菌株间水平传播。由于各地区产ESBLs大肠埃希菌耐药基因携带情况存在一定差异，为此我们收集了云南省玉溪市江川区人民医院临床分离的产ESBLs大肠埃希菌，研究该地区AME基因及16S rRNA甲基化酶基因的细菌携带情况，有助于了解该地区细菌的耐药性及耐药机理，以指导临床治疗的药物选择。
一、菌株来源
32株产ESBLs大肠埃希菌和8株不产ESBLs大肠埃希菌均为云南省玉溪市江川区人民医院检验科细菌室2014年1月至2015年2月的临床分离株，其中分离自分泌物17株、痰液13株、尿液6株、血液3株、脑脊液1株。
二、仪器和试剂
全部菌株均使用VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统（法国生物梅里埃公司）鉴定。标准菌株为大肠埃希菌（ATCC 25922）。Taq酶购自日本Takara公司。药物敏感性试验纸片购自美国BD公司。水解酪蛋白胨琼脂平板购自上海伊华公司。ABI 7270 PCR仪由美国ABI 公司生产。引物序列根据美国GenBank基因数据库序列，使用Primer 5软件设计，由上海生工生物工程有限公司合成。
三、方法
1.ESBLs检测 ESBLs检测采用美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推荐的酶抑制剂增强纸片扩散法。头孢噻肟、头孢他啶及相应的含酶抑制剂头孢噻肟-克拉维酸、头孢他啶-克拉维酸纸片中任何1对的抑菌环直径之差≥5 mm 为产ESBLs菌株。
2.体外药物敏感性试验 采用纸片扩散法测定32株产ESBLs大肠埃希菌和8株不产ESBLs大肠埃希菌对5种氨基糖苷类抗菌药物（庆大霉素、阿米卡星、奈替米星、妥布霉素、卡那霉素）的耐药性。根据CLSI文件（2014年版）要求进行抗菌药物敏感性判断。
3.DNA抽提 挑纯培养菌落置入0.5 mL离心管内（管内预置200 ng/mL蛋白酶K溶液200 μL），56 ℃裂解2 h， 95 ℃裂解10 min，18 000×g离心2 min，上清液即为基因检测的模板液，-20 ℃保存备用。
4.基因检测 采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测7种AME基因[aac（3）-Ⅰ、aac（3）-Ⅱ、aac（6′）-Ⅰad、aac（6′）-Ⅰb、aac（6′）-Ⅱ、ant（3″）-Ⅰ、ant（2″）-Ⅰ]和6种16S rRNA甲基化酶基因（armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA）。靶基因引物序列及目的产物片段长度见表1。PCR反应体系：总体系为25 μL，GXL酶 0.5 μL，5×GXL缓冲液5 μL，dNTP 2 μL，DNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，无菌水补足至25 μL。扩增条件：94 ℃预变性5 min； 98 ℃变性 10 s、60 ℃退火15 s、68 ℃ 延伸1 min，共进行35个循环；72 ℃延伸10 min结束反应。扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，出现与阳性对照相当的目的条带为阳性。
5.阳性基因测序 纯化后的PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序，测序方法为双脱氧末端终止法，仪器为ABI 3730型基因分析仪（美国ABI公司）。测序结果与GenBank基因数据库进行序列比对。
表1 靶基因引物序列和目的产物长度
类型基因名称引物序列（5'～3'）产物长度（bp）AMEaac（3）-ⅠP1：CACCTACTCCCAACATCAGCC331 P2：TTCTTCCCGTATGCCCAACT aac（3）-ⅡP1：ATGCATACGCGGAAGGCAATAACGG861 P2：CTAACCTGAAGGCTCGCAAGAGC aac（6′）-ⅠadP1：CCAAGATCCACCATTATTAGC193 P2：CGTATTCGTCCCTTCAACAT aac（6′）-ⅠbP1：TGCGATGCTCTATGAGTGGC358 P2：GTCCGTTTGGATCTTGGTGA aac（6′）-ⅡP1：TGATGGCTGGTGGGAAGATG191 P2：AGCGTATGGCTCGATGGTTG ant（3″）-ⅠP1：ATCATTCCGTGGCGTTATCC347 P2：CAGTCGGCAGCGACATCCTT ant（2″）-ⅠP1：ACAACGCAGGTCACATTGATACAC269 P2：CACCAAGCAGGTTCGCAGTC 16S rRNA甲基化酶armAP1：CGCGGATCCATGGATAAGAATGATGTTGTTAAG774 P2：CCGCTCGAGTTATTATTTCTGAAATCCACTAGT rmtAP1：CGCGGATCCATGAGCTTTGACGATGCCCTAGCGT769 P2：CCGCTCGAGTTATCACTTATTCCTTTTTATCATGTA rmtBP1：CGCGGATCCATGAACATCAACGATGCCCTCACCT756 P2：CCGCTCGAGTTATCCATTCTTTTTTATCAAGTA rmtCP1：CGCGGATCCATGAAAACCAACGATAATTAT846 P2：CCGCTCGAGTTACAATCTCGATACGATAAAATAC rmtDP1：CGCGGATCCATGAGCGAACTGAAGGAAAAACTGCT744 P2：CCGCTCGAGTCATTTTCGTTTCAGCACGTAAACAG npmAP1：CGCGGATCCATGTTAATACTCAAAGGAACAAAGAC660 P2：CCGCTCGAGTTAATGTTTTGAAACATGGCCAG
一、药物敏感性试验结果
32株产ESBLs大肠埃希菌对庆大霉素、阿米卡星、奈替米星、卡那霉素和妥布霉素的耐药率分别为100%、0%、0%、18%和87%；8株不产ESBLs大肠埃希菌对庆大霉素、阿米卡星、奈替米星、卡那霉素和妥布霉素均敏感。见表2。
表2 产或不产ESBLs大肠埃希菌对5种氨基糖苷类抗菌药物的耐药率 [株（%）]
抗菌药物产ESBLs大肠埃希菌（32株）不产ESBLs大肠埃希菌（8株）敏感中介耐药敏感中介耐药庆大霉素0（0）0（0）32（100）8（100）0（0）0（0）阿米卡星32（100）0（0）0（0）8（100）0（0）0（0）妥布霉素0（0）4（13）28（87）8（100）0（0）0（0）奈替米星27（85）5（15）0（0）8（100）0（0）0（0）卡那霉素0（0）26（82）6（18）8（100）0（0）0（0）
二、基因检测结果
32株产ESBLs大肠埃希菌中检出4种AME基因，分别为aac（3）-Ⅱ 32株（100%）、aac（6'）-Ⅰb 3株（9.4%）、ant（3'）-Ⅰ 2株（6.2%）、ant（2'）-Ⅰ 1株（3.1%）；均未检出16S rRNA甲基化酶基因；有6株菌株同时检出2种基因。见表3。
表3 32株产ESBLs大肠埃希菌AME基因检测结果
基因名称阳性株数阳性率（%）aac（3）-Ⅱ32100.0 aac（6'）-Ⅰb 3 9.4 ant（3'）-Ⅰ 2 6.2 ant（2'）-Ⅰ 1 3.1 aac（3）-Ⅱ+aac（6'）-Ⅰb 3 12.5 aac（3）-Ⅱ+ant（3'）-Ⅰ 2 6.2 aac（3）-Ⅱ+ant（2'）-Ⅰ 1 3.1
8株不产ESBLs大肠埃希菌均未检出AME基因及16S rRNA甲基化酶基因。
三、PCR产物测序结果
32株产ESBLs大肠埃希菌中有4株发生aac（3）-Ⅱ突变，且该4株菌株有相同的4种基因有意突变，分别为 G232A（谷氨酸突变为赖氨酸）、T251C（亮氨酸突变为脯氨酸）、G580A（天门冬氨酸突变为天门冬酰胺）、T612A（天门冬氨酸突变为谷氨酸）。见图1。
图1 发生aac（3）-Ⅱ突变的PCR产物测序结果
注：（a）G232A；（b）T251C；（c）G580A；（d）T612A；箭头表示突变峰
氨基糖苷类抗菌药物抗菌谱广、疗效卓越，已在临床得到广泛应用。但近年来由于抗菌药物的滥用和过度治疗，其耐药性日趋严重。特别是产ESBLs大肠埃希菌对β-内酰胺酶类抗菌药物严重耐药的同时，对氨基糖苷类抗菌药物的耐药率也明显升高[5-6]，浙江[7]、江苏[8]、河北[9]、重庆[10]等地的耐药率均已超过80%。
本研究结果显示，云南省玉溪市江川区人民医院临床分离的32株产ESBLs大肠埃希菌对庆大霉素的耐药率最高（100%），其次为妥布霉素（87%），奈替米星和阿米卡星的耐药率均为0%。这可能与阿米卡星、奈替米星经过结构改造，对AME具有一定的稳定性有关[9]，所以其耐药率远低于庆大霉素和妥布霉素。
氨基糖苷类抗菌药物的多种耐药机制可以共存于—株细菌中。现已阐明的耐药机制包括此类药物作用靶点16S rRNA或核糖体蛋白突变、外膜通透性降低或内膜转运障碍、激活的外排泵将药物主动泵至细胞外[11-12]，其中最主要的机制是1种或多种AME修饰介导的氨基糖苷类抗菌药物失活及16S rRNA甲基化酶对16S rRNA的甲基化作用。本研究结果显示，32株产ESBLs大肠埃希菌中检出了4种AME基因，分别为aac（3）-Ⅱ、aac（6'）-Ⅰb、ant（3'）-Ⅰ及ant（2'）-Ⅰ，未检出16 SrRNA甲基化酶基因。且产ESBLs大肠埃希菌的AME基因携带率高达100%，aac（3）-Ⅱ基因阳性率极高，与罗建华[13]报道的结果[产ESBLs菌株aac（3）-Ⅱ基因阳性率高达94.1%]相似，但与芮球红等[7]、黄永茂等[14]的报道有差异，原因可能是耐药细菌质粒介导的产ESBLs菌株具有区域特征性，不同区域有着不同的耐药基因特征。本研究结果显示，云南省玉溪市江川地区产ESBLs大肠埃希菌对氨基糖苷类抗菌药物的耐药机制主要与AME基因[特别是aac（3）-Ⅱ]的表达有关。
研究发现大多数耐药菌株均含有多重耐药机制[7，9，14]。本研究32株产ESBLs大肠埃希菌中全部携带有1种或多种酶基因，其中有6株（19%）同时含有2种酶基因。这些多种耐药基因并存会使菌株对多种氨基糖苷类抗菌药物产生耐药，导致治疗失败，因此临床应予以关注[15]。产ESBLs菌株携带ESBLs基因质粒的同时含有1个或多个AME基因，带有AME基因的质粒可经接合转移方式在细菌间扩散并传递耐药基因。文献也提示多数菌种，特别是肠杆菌科细菌的酶基因位于质粒或转座子上，并常和ESBLs相关联，导致多重耐药[16]。
有研究发现大肠埃希菌对氨基糖苷类抗菌药物的耐药性与AME基因表达明显相关[15]。本研究结果显示，同是携带AME基因的菌株对氨基糖苷类抗菌药物的耐药程度不尽相同。因此，为进一步探讨其耐药机制，本研究对aac（3）-Ⅱ的基因进行了测序分析。
奈替米星作为第3代氨基糖苷类抗菌药物，对aac（3）-Ⅱ稳定，提高了对该酶的耐受性。本研究结果显示，32株产ESBLs大肠埃希菌中未检测到奈替米星耐药株，但在5株奈替米星中敏菌株中有4株aac（3）-Ⅱ基因发生了相同的4个位点的点突变（G232A、T251C、G580A和T612A），导致相应氨基酸被改变[aac（3）-Ⅱ结构域中78位谷氨酸突变为赖氨酸、84位亮氨酸突变为脯氨酸、194位天门冬氨酸突变为天门冬酰胺、204位天门冬氨酸突变为谷氨酸]。钝化酶作用于氨基糖苷类抗菌药物特定的氨基或羟基，从而使药物发生钝化，被钝化的药物很难与核糖体结合，使加速药物摄入的能力依赖阶段Ⅱ不能进行，从而导致耐药。本研究结果显示，发生aac（3）-Ⅱ基因突变的4株产ESBLs大肠埃希菌相对于其他28株菌株，其钝化酶基因均发生了相同的有意突变，且成为中敏株，因此可以推测，该4个位点的突变导致aac（3）-Ⅱ二级结构及功能发生改变，增强了对抗菌药物的钝化作用，导致细菌耐药性增强。另外，还有1株中敏菌株未检测到有意突变，其原因可能是奈替米星作为第3代氨基糖苷类抗菌药物，在结构上作了改进，使得aac（3）-Ⅱ对奈替米星的修饰作用受到部分限制，但不能完全排除影响[17]。
综上所述，云南玉溪市江川地区产ESBLs大肠埃希菌对氨基糖苷类抗菌药物的耐药情况严重，特别是对庆大霉素和妥布霉素的耐药率很高，其耐药性与AME基因的表达有关。aac（3）-Ⅱ基因232位、251位、580位及612位4个位点的点突变可能与奈替米星的耐药性增强有关。
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（本文编辑：龚晓霖）
Drug resistance of ESBLs-producing Escherichia coli to aminoglycosides and the sequences of drug resistant genes
WU Rong1，Lü Yujiang2，DAI Junhua1，XIANG Fenfen1，KONG Qianqian1，QIAN Ning1，ZHANG Guiliu2，YANG Yuling2，CHEN Lichun2，KANG Xiangdong1.
（1. Department of Clinical Laboratory，Putuo Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200062，China；2. Department of Clinical Laboratory，the People's Hospital of Yuxi City Jiangchuan District，Yuxi 652600，Yunnan，China）
Abstract：Objective To study the drug resistance of extended-spectrum beta-lactamases（ESBLs）-producing Escherichia coli to aminoglycosides and the expression frequencies and sequences of drug resistant genes in Jiangchuan District，Yuxi City，Yunnan Province. Methods The drug resistance of 32 isolates of ESBLs-producing Escherichia coli to gentamycin，amikacin，kanamycin，tobramycin and netilmicin was determined by disk diffusion test. A total of 7 aminoglycoside-modifying enzyme（AME） genes [aac（3）-Ⅰ，aac（3）-Ⅱ，aac（6′）-Ⅰad，aac（6′）-Ⅰb，aac（6′）-Ⅱ，ant（3″）-Ⅰ and ant（2″）-Ⅰ]and 6 genes of 16S rRNA methylases（armA，rmtA，rmtB，rmtC，rmtD and npmA） were determined by polymerase chain reaction（PCR），and the sequence of aac（3）-Ⅱgene was analyzed by double deoxidizing terminal cessation method. Results The drug resistant rates of 32 isolates of ESBLs-producing Escherichia coli to gentamycin，amikacin，netilmicin，kanamycin and tobramycin were 100%，0%，0%，18% and 87%，respectively. It was found that 2 AME genes existed simultaneously in 6 isolates. The positive rates of 4 AME genes，aac（3）-Ⅱ，aac（6′）-Ⅰb，ant（3″）-Ⅰ and ant（2″）-Ⅰ，were 100%，9.4%，6.2% and 3.1% in 32 isolates. There was no gene of 16S rRNA methylases. The aac（3）-Ⅱ mutations existedin 4 out of 32 isolates，which were G232A，T251C，G580A and T612A，respectively. There was no gene of AME and 16S rRNA methylases in 8 isolates of ESBLs-producing Escherichia coli. Conclusions The drug resistance of ESBLs-producing Escherichia coli to aminoglycosides was correlated with AME gene expressions，and the mutations of aac（3）-Ⅱ may contribute to the increased drug resistance to netilmicin.
Key words：Escherichia coli；Aminoglycoside-modifying enzyme genes；16S rRNA methylase gene
文章编号：1673-8640（2016）011-0959-06
中图分类号：R378.2
文献标志码：A
DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2016.011.007
基金项目：上海市普陀区江川/医联体课题（2013JY102I）
作者简介：吴 蓉，女，1970年生，学士，主任技师，主要从事临床微生物学检验工作。
通讯作者：康向东，联系电话：021-62160801。
收稿日期：（2016-05-20）
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